Bacterial Expression vector Introduction Expression of cloned genes in Escherichia coli Expression of cloned genes in other bacteria Conclusion.

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Presentation transcript:

Bacterial Expression vector Introduction Expression of cloned genes in Escherichia coli Expression of cloned genes in other bacteria Conclusion

Introduction  promoter  plasmid copy number  activity of protein (fusion protein)

Introduction

promoter  可誘導式 (inducible) 適用於希望將宿主細胞的生長階段 (growth phase) 與蛋白質的生產階段 (production phase) 加以區分，同時將生產蛋白質的時間儘量縮短，使醱酵培養得以順利進行  非誘導式 (non-inducible ； constitutive) 適用於基因工程蛋白質對宿主細胞的生長沒有影響 Introduction

promoter

 bacteriophage P L promoter regulated by a temperature-sensitive repressor cIts857, which represses transcription at low temperature tac promoter (trp-lac promoter) -35 region of the trp promoter -10 region of the lac UV5 promoter trc promoter (trp-lac promoter) -35 region of the trp promoter -10 region of the lac UV5 promoter 16 bp. 17 bp.

Lac promoter

trp promoter

plasmid copy number pET vector

Fusion protein 利於分離目標蛋白質有些 carrier protein 可以保護目標蛋白質免受蛋白質水解酵素的破壞有些 carrier protein 可以幫助目標蛋白質增加溶解度避免形成不可溶的 inclusion bodies

Fusion protein

Table 15-1 Vectors for Construction of Fusion Proteins Fusion protein Vector SystemFusion Partner a CommentReference/Source pUC, pSK, pBluescript, pGEM  -galactosidase Expression under control of the lac promoter-operator system. Stratagene ( Life Technologies ( pTA1529 or pBAcealkaline phosphatase PhoA signal sequence facilitates transport to periplasm. Oka et al. pGEX seriesGSTIPTG-inducible promoter; available with cleavage sequences. Smith and Johnson (1988) Pharmacia pMAL seriesMBPIPTG-inducible promoter; MBP signal sequence facilitates export to periplasm. di Guan et al. (1988); Maina et al.(1988) New England Biolabs ( pTrx, pTrxFusTrxIPTG-inducible promoter; available with enterokinase cleavage sequences. La Vallie et al. (1993) Invitrogen ( pET seriespoly-His tag, selected vectors also carry tags for GST, Trx, DsbA, and DsbC, CBD T7 promoter (IPTG-inducible); available with sites for chemical, cleavage. Studier et al. (1990) Novagen ( Promega ( a (GST) Glutathione S-transferase; (MBP) maltose-binding protein; (Trx) thioredoxin; (DsbA and Dsbc) disulfide bond formation (periplasmic localization); (CBD) cellulose-binding domain. 大部分的 fusion protein 均可以 affinity chromatography 純化出來目前約有 20 種不同的 fusion protein system

Fusion protein Fusion protein 的切除化學法 (chemical) 酵素法 (enzyme) Affinity purification

Fusion protein

Fusion protein 的去除：酵素法

Fusion protein

Fusion protein 的去除： affinity purification

Expression of cloned genes in E. coli  pGEX system  pET system  pQE system

pGEX system promoter: Ptac (trp-lac promoter) fusion protein: GST (glutathione S-transferase)

pGEX system

pET system promoter: T7 promoter / T7 promoter + lac operon fusion protein: poly-His tag, GST, MBP, Trx, DsbA and DsbC,CBD (GST) Glutathione S-transferase; (MBP) maltose-binding protein; (Trx) thioredoxin; (DsbA and Dsbc) disulfide bond formation (periplasmic localization); (CBD) cellulose-binding domain

pET system

Stratagene pET3 系列 : promoter 為 T7

Stratagene pET11 系列 : promoter 為 T7/lac O

Novagen