微生物研究法 D 組 報告者：曾仁志 報告日期： 2005/9/19 題目： (1)CO 2 、 Sodium bicarbonate 和 HEPES buffer 對培養基 pH 值的調控。 (2) 成立一個細胞學實驗室需要什麼需求。

培養基 pH 值的變動對細胞造成的影響 哺乳動物細胞最適生長的 pH 範圍為 7.2~7.4 ，過酸或過鹼 都會對細胞生長不良或造成傷害，故讓培養基的 pH 值穩定 是相當重要。 For example ： Articular Chondrocytes( 關節軟骨細胞 ) ，主要的能量來 源是透過糖解作用之無氧代謝， Pyruvate 轉換成 lactic acid ，會迅速酸化培養基而導致抑制細胞生理及代謝。 Glucose Glycolysis Glucose-6-phosphate Pyruvate Lactic acid pH↓ Cell

CO 2 、 Sodium bicarbonate 和 HEPES buffer 對培養基 pH 值的調控 培養基的 pH buffer system 最常用 NaHCO 3 加入培養 基中，以 CO 2 來調整 pH 在適當之範圍 (HCO H + H 2 CO 3 CO 2 + H 2 O) 。 ※細胞生長需要 CO 2 的環境，然而在 CO 2 incubator 不斷 的補充 CO 2 下，培養基會越來越酸。加 sodium bicarbonate 進去，使 HCO 3 - 去抓住 H + 來平衡 pH 值。 然而在細胞生長快速及 carbonic anhydrase 的存在下， 培養基會酸化的更快，故以添加 HEPES 來穩固細胞生 長最適之 pH 的環境。

CO 2 、 Sodium bicarbonate 和 HEPES buffer 對培養基 pH 值的調控

HEPES 當培養基之緩衝液之優缺點 以 HEPES 當培養基之緩衝液之優缺點 優點：對細胞毒性較小，適用於多種類型細胞的培養。 ( 參見 表一 ) 盡可能避免光照 缺點：長期暴露於光照下， 會產生具細胞毒性之自由基。 ( 但是只要避光保存便可避免， 此問題較易解決。 )

參考資料 表一、各種常用緩衝液及其使用範圍 緩衝液適用 pH 值使用上注意 Formate3.0~4.5 會溶解細胞膜上的蛋白質。 Citrate3.0~6.2 小心會與二價金屬離子結合。 Acetate3.7~5.5 容易揮發，可用冷凍乾燥除去。 Phosphate5.8~8.0 小心會與鈣離子結合沉澱，低溫下易結晶。 HEPES6.5~8.5 毒性較小多用在細胞培養。 Tris7.1~8.9 pH 值受溫度影響很大。 Carbonate9.7~10.7 小心會與金屬離子結合沉澱。

Phosphate buffer with or without Ca 2+ Phosphate buffer without Ca 2+ ： 多應用於細胞培養之沖洗。 With or without Ca 2+ ? Why ?

Phosphate buffer with or without Ca 2+ Phosphate buffer 與鈣離子結合沉澱的原因： 溶液的 pH 值  在溶液中，磷酸鹽是以三價的磷酸根（ PO 4 3- ）、二價的磷酸氫根 （ HPO 4 2- ）和一價的磷酸二氫根（ H 2 PO 4 - ）存在，這三個離子會 維持一個平衡的狀態，但是 PO 4 3- 要在強鹼（ pH 值很大時）的情 況下才會存在，所以在 phosphate buffer 溶液中只可能以 HPO 4 2- 及 H 2 PO 4 - 存在。  HPO 4 2- 較會和鈣離子產生沉澱。在 pH 值 7.4 時會有 80% 的 HPO 4 2- 存在，較會和鈣離子產生沉澱；若 pH 值下降至 5.4 時，則有 96% 的 H 2 PO 4 - 的存在，這樣一來就減少產生磷酸鈣沉澱的機會。所以 溶液 pH 值影響鈣磷沉澱很大， pH 值較低時，發生沉澱的機會也 較低。

Phosphate buffer with or without Ca 2+

成立一個細胞學實驗室的基本需求 設計細胞實驗室之基本考量 1. 細胞培養最害怕的就是污染的問題，因此提供一個無 菌的設備、環境及無菌操作技術是十分重要的 。 UV 殺菌燈

設計細胞實驗室之基本考量 無菌操作臺滅菌器

設計細胞實驗室之基本考量 2. 細胞培養室與其他工作室隔離，需有 2~3 道門，要有 緩衝區來更換鞋子與實驗衣。 Air shower

設計細胞實驗室之基本考量 3. 細胞培養箱、冰箱、桌上型離心機、顯微鏡等設備 。 Incubator 冰箱

細胞實驗室之基本配備 離心機顯微鏡

細胞實驗室之基本配備 其他設備 1. 水浴槽 2. 液態氮 ℃ 、 -80 ℃ 、 4 ℃ 等冰箱。 4. 其他的視實驗需求而定。

參考文獻 Fisk A., Pathak S., (1969) HEPES-buffered medium for organ culture. Nature. 224, Waldman S.D., Couto D.C., Omelon S.J., Kandel R.A., (2004) Effect of sodium bicarbonate on extracellular pH, matrix accumulation, and morphology of cultured articular chondrocytes. Tissue Engineering. 10,