Gena- og gagnasöfn (GEG1103) Fyrirlestrar Umritamengi DNA-flögur (microarrays)

Umritamengi Genamengi (genome): Hvað getur lífveran gert? Umritamengi (transcriptome): Hvað er lífveran að gera? Breytilegt milli vefja og með tíma Geta verið mjög praktískar upplýsingar Þúsundir gena tjáðar samtímis  óhentugt að einangra hvert umrit fyrir sig  þurfum aðferð sem getur skimað mikinn fjölda umrita samtímis

DNA-flögur (microarrays)  Box bls í Lesk   Nýleg tækni. Fyrst lýst af Schena et al (Science 270, )  Lesum tjáningu þúsunda gena samtímis  Berum saman tjáningu milli tilraunaaðstæðna

Kjarnsýra ýmist “spottuð” (array) eða “prentuð” á glerflögu með photolithography (chip) Tækni fengin úr hálfleiðara-iðnaðinum Oftast cDNA oligonucleotide (~ basar) Prentunartækni Affymetrix við gerð GeneChip ® DNA-flagna DNA-flögur (microarrays)

–mRNA einangrað úr vef –mRNA merkt, t.d. með flúrljómandi efni –mRNA-ið binzt (basaparast) við samsvarandi röð á flögunni

DNA-flögur (microarrays) Einlitar flögur: –eitt sýni, merkt með einu litarefni –hver depill táknar eitt gen –því dekkri depill, þess meira magn af mRNA umriti Þurfum gagnabanka sem segir hvaða gen er í hverjum punkti

Tvílitar DNA-flögur ( two channel microarrays ) Tvö mismunandi sýni: –Kontról (grænn litur – t.d. Cy3) –Sample (rauður litur – t.d. Cy5) Bæði sýnin látin á sömu flöguna og basapörun látin eiga sér stað –Hver depill getur nú fengið einn af 4 mögulegum litum

Tvílitar DNA-flögur ( two channel microarrays ) 4 litir: –Grænn –Grænn: tjáning hærri í kontról-sýni –Rauður –Rauður: tjáning hærri í tilrauna-sýni –Gulur –Gulur: jöfn tjáning í báðum sýnum –Svartur –Svartur: engin tjáning Magngreinum tjáninguna afstætt Getum flokkað gen eftir tjáningarmunstri

Hierarchical Clustering Getum stillt upp mörgum tilraunum og flokkað gen eftir tjáningu við mismunandi aðstæður

Krol & Becker 2004 Sinorhizobium meliloti –  -proteobaktería –vex í samlífi með baunaplöntum –myndar rótarhnúða (root nodules) –Rm1021 tjáir phoD óskilyrt (constitutive), en í Rm2011 er phoD aðeins tjáð við fosfatskort –RmH406: phoB stökkbrigði

Krol & Becker 2004 “Pho regulon” –PhoB og PhoR stýra tjáningu fjölda gena (a.m.k. 31 gen í E. coli), þ.m.t.  S –Virkjast við fosfórskort –phoCDET operon (tjáir fosfat-ferju) er stýrt af PhoB/R í S. meliloti, tjáning eykst við fosfatskort –Tjáning pit operons minnkar við fosfatskort

Krol & Becker 2004  DNA-flögur búnar til:  6223 fákirni (70-liður) smíðuð skv. S. meliloti genamengi á NCBI  Rm1021, Rm2011 & RmH406 ræktaðar í æti með  100 mM Pi  2 mM Pi  0,1 mM Pi  mRNA safnað og cDNA búið til og merkt með Cy3 og Cy5  Tjáning pit og phoC er eins og við mátti búast  DNA- flögurnar virka rétt

Krol & Becker

Krol & Becker

Krol & Becker 2004 Hierarchical clustering sýnir 3 megin-hópa gena sem fosfórskortur og/eða phoB hafði áhrif á –I: Tjáning eykst við fosfórskort og er háð phoB –II: Tjáning óháð phoB, en er samt aukin við fosfórskort –III: Tjáning minnkuð við fosfórskort, óháð phoB