Современные технологии анализа точечного нуклеотидного полиморфизма. Генотипирование человека.

+ Методы анализа SNP Аналитические детекторы Химия анализа По электрофоретической подвижности полиморфных фрагментов SSCP Гетеродуплексный анализ Детекция на твердой фазе гибридизация на олигонуклеотидных матрицах оптиковолоконный ДНК гибридизационный анализ элонгация иммобилизованных праймеров (минисеквенс) пиросиквенс Хроматографические методы CDGE, TGGE, DGGE, DHLPC Физические методы MALDI-TOF, TAQ-MAN Ферментативные подходы: RFLP AFLP CFLP EMD LDR, LCR, Padlock Invader RAPD, AP-PCR DT-PCR AS-PCR Химические методы химическое расщепление гетеродуплексов химическое лигирование Химия анализа Аналитические детекторы Высокопроизводительный анализ SNP +

ПЦР-аплификация Рестрикция Электрофорез ПЦР-ПДРФ (PCR-RFLP) – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПЦР-аплификация Рестрикция Электрофорез

Структура TaqMan® MGB зонда NFQ MGB R MGB увеличивает температуру плавления (Tm) зонда. Возможно применение более коротких зондов. Лучше дискриминация точечных замен R : Репортер TaqMan® MGB probes consist of a reporter dye on the 5’ end (either VIC™ or FAM™) and a non-fluorescent quencher, and a minor groove binder (MGB) on the 3’ end. MGB probes have a modified 3’ end compared to standard (TAMRA) probes. The TAMRA label on the 3’ end is replaced with a non-fluorescent quencher, which allows for better measurement of fluorescent contributions. MGB enhances the melting temperature of the probe by stabilizing the double stranded structure. This means that the specific oligonucleotide region can be much smaller. The SNP then contributes much more to the specificity of each individual probe. Oligos are usually 13-20 bases in length. NFQ : Нефлюоресцентный гаситель MGB : Minor Groove Binder (Tm Enhancer)

SNP анализ Используются мультиспектральные зонды Аллель 1 – генерируется сигнал от зонда с красителем VIC NFQ NFQ FAM VIC A C G C Аллель 2 – генерируется сигнал от зонда с красителем FAM NFQ NFQ FAM VIC G T A T

Хроматографическая дискриминация точечных мутаций DHPLC - (denaturating high-performance liquid chromatography)

Хроматографическая дискриминация точечных мутаций DHPLC - (denaturating high-performance liquid chromatography)

Клевазный тест- Third Wave Tech. - Invader assay 25-35 bases Invader Oligo - Mut Probe Tm span + 2-3 C

Pyrosequencing light time

Affymetrix Inc.

Предлагаемый нами аналитический подход Химия анализа: Реакция минисеквенирования на матрице ПЦР-амплифицированной ДНК Легко стандартизируется, не критична к температурным режимам гибридизации Аналитическая часть: Масс-спектрометрический анализ продуктов реакции Не требуется использование изотопных или флуоресцентных меток, высокая точность и скорость анализа

Реакция минисеквенирования A G T PCR ssDNA Отжиг олигонуклеотидного зонда + ddT, +ddC, +ДНК полимераза или Детекция С

Масс-спектрометрический этап Принцип: Измерение отношения массы заряженных частиц к их заряду Требования: Разделение достроенных олигонуклеотидных зондов, отличающихся по 3’-окончанию. Аналитический диапазон: 4000 – 8000 Da. Ионизация Регистрация масс-спектра Сортировка заряд/масса Необходимая точность: +/- 9 Da (разница между ddT и ddC)

MALDI-TOF Регистрация -TOF (Time of Flight) Ионизация -MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption\Ionization) лазерная десорбция и ионизация в присутствии вспомогательного вещества – матрицы МАТРИЦА: * Поглощает энергию лазерного излучения, “вскипая” увлекает в газовую фазу молекулы анализируемого вещества * Способствует ионизации Регистрация -TOF (Time of Flight) Измерение времени (time of flight) требующегося ионам для достижения детектора (пропорционально квадратному корню соотношения заряд/масса)

Масс-спектрометрический этап Проблемы: Деградация нуклеиновых кислот входе ионизации Многозарядность Образование комплексов с другими заряженными молекулами Решения: Применение MALDI-TOF схемы масс-спектрометрии Хроматографическая очистка аналита на ионнообменной смоле

Разрешение и точность MALDI-TOF-MS разрешение

Reflex IV (Bruker Daltonics) Масс-спектрометрический этап Reflex IV (Bruker Daltonics)

Масс-спектрометрический этап Аналитическая мишень: AnchorChip 400TF-384 (Bruker Daltonics) Стальной тефлонизиро-ванный планшет на 384 образца Матрица: 3-гидроксипиколиновая кислота

Масс-спектрометрический этап Снятие спектра в автоматическом режиме 30 импульсов / 10 секунд / 1 образец

Интерпретация: 7023-6693 = 330 Da (dG) 7321-7023 = 298 Da (ddA) исх. +dG +ddA Интерпретация: 7023-6693 = 330 Da (dG) 7321-7023 = 298 Da (ddA)

Принципиальная аналитическая схема

Разработка высокопроизводительной аналитической схемы Проблемы Решения Очистка ампликонов перед реакцией минисеквенирования SAP-дефосфорилирование dNTP Оптимизация реакции минисеквенирования Использование рекомбинантной ДНК полимеразы, эффективно включающей ddNTP Очистка образцов перед MALDI-TOF спектрометрией 1) Реакционные буферы без K, Tris H-Cl 2) Ионнообменная хроматография Повышение чувствительности системы 1) Масс-тюнинг олигонуклеотидов 2) Использование AnchorChip планшетов

Разработка высокопроизводительной аналитической схемы Амплификация, дефосфорилирование, минисеквенирование в микропланшетном формате (96 или 384 образцов)

Разработка высокопроизводительной аналитической схемы Автоматизированное нанесение образца на мишень при помощи Biomek 2000 Wor- kstation (Beckman Coulter) Объем образца – 200 nl.

Дальнейшие перспективы: Мультиплексорность (Ross et al. Nature Biotechnology 1998)

Мультиплексорность (Ross et al. Nature Biotechnology 1998)

Название/ Производитель Зарубежные аналоги и другие высокопроизводительные системы генотипирования Название/ Производитель Метод (Химия/Детекция) Производи-тельность SNP/день MassArray 200 K System (Sequenom) Минисиквенс/MALDI-TOF 200 000 Genolink (Bruker Daltonics) 1440 Pyrosequencing (Biotage AB) Минисиквенс/люминисцентная детекция 10 000 TaqMan Assay (Applied Biosystems) Дискриминирующая гибридизация /флуоресцентная детекция 9000

Значимость анализа SNP. Исследовательский аспект Идеальные маркеры для геномного скрининга Среднее растояние между маркерами ~1000нт-5000нт Поиск кандидатных генов мультифакториальных заболеваний Удобные маркеры молекулярной эволюции

Значимость анализа SNP. Прикладное значение Генетическая паспортизация человека. Индивидуализированное определение уже известных SNP-профилей, ассоциированных с: предрасположенностью к развитию мультифакториальных заболеваний: Кардиоваскулярные патологии Нейродегенеративные заболевания Злокачественные новообразования индивидуальной чувствительностью к лекарственной терапии

Генотипирование Геном – совокупность всего генетического материала организма Генотип – совокупность данных о всех или избранных вариантах генетического материала. Точечный нуклеотидный полиморфизм Делеции, инсерции Хромосомные аберрации Генотипирование – комплекс лабораторных процедур, направленных на получение информации о генетическом статусе индивидуума.

Генотипирование Вопросы и ответы… Задачи и значимость генотипирования человека? Объект исследования? Методика? Интерпретация результата?

Генотипирование в медицине Информационная значимость Оценка индивидуальных рисков развития мультифакторных заболеваний Оценка индивидуальной предрасположенности/резистентности к инфекционным заболеваниям Определение индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам Информация, актуальная при планировании семьи Формат индивидуальной медицины Медицинский генетический паспорт

Важное замечание… Генотипирование – это скрининговая процедура, направленная на анализ наследуемых признаков. Процедуру генотипирования достаточно выполнить единственный раз, так как в ходе исследования определяются генетические комбинации единожды унаследованные от генетических родителей.

SNP Объект исследования? single nucleotide polymorphism точечный нуклеотидный полиморфизм а так же непротяженные инсерции и делеции в нуклеотидной последовательности

Геном человека – предположительно до 10 млн SNP. Точечный нуклеотидный полиморфизм – элементарная аналитическая единица генетического исследования SNPs (single nucleotide polymorphisms) - однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в некоторой популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели), причём редкий аллель встречается с частотой не менее 1% (Brookes, A.J. 1999. The essence of SNP. Gene 234:177-186) Пример: замена G на A в позиции 1691 гена V фактора свертывания крови (Ляйденовская мутация) Геном человека – предположительно до 10 млн SNP. Точечный нуклеотидный полиморфизм, а так же более крупные генетические повреждения (делеции, хромосомные аберрации) являются формальной причиной развития как моногенных, так и мультифакторных заболеваний

Информация о медицински значимых полиморфизмах – результат научно-исследовательских работ Технологические и биоинформационные возможности современных медицинских лабораторий позволяют использовать эти знания в диагностических целях

Публикации в год по взаимосвязи генотип-фенотип

Актуальные направления медицинского генотипирования Категории/полиморфизмы Сердечно-сосудистые заболевания - 1700 Онкологические заболевания - 5700 Нейро-дегенеративные заболевания - 1800 Заболевания обмена веществ - 1400 Фармакогеномный анализ – 900 ПРИМЕРЫ…

Коагуляционный каскад

Diet Acetyl CoA Fatty Acids Cholesterol Транскрипционные факторы и их лиганды в регуляции обмена холестерина и жирных кислот PPAR Cholesterol Lanosterol Isoprenoids Acetyl CoA 7-Dehydro- Oxysterols ABCA1, G1, G5, G8 Insects Fatty Acids LXR CYP4A ABCB4, D2, D4 Diet 1,25-Dehydroxy- Vitamin D3 VDR CYP24 20-Hydroxy- Ecdysone EcR 26OHase E23 CYP7A1 Bile Acids FXR Retinoic Acids CYP26 PXR CAR Xenobiotics Steroids RAR RXR CYP3A  CYP2B ABCB1, C2, D3 CYP7A1 CYP8B1 ABCB11 CYP27B1 Plants

Полиморфизмы генов системы свертывания крови

Полиморфизмы генов системы свертывания крови

Печальные примеры… Смерть двухкратного олимпийского чемпиона Сергея Гринькова. Возможные причины развития острого коронарного синдрома – повышенная адгезия тромбоцитов вследствие мутации C –1565-T (L33P) в гене фактора агрегации тромбоцитов GPIIIA Lancet. 1996 Jun 29;347(9018):1833. “Clues to the death of an Olympic champion.” Goldschmidt-Clermont PJ, Shear WS, Schwartzberg J, Varga CF, Bray PF.

Полиморфизмы генов липидного обмена Полиморфизмы предрасположенности к развитию гипертензивных состояний

Генетические факторы предрасположенности к онкологическим заболеваниям Рак молочной железы и яичников Делеционные мутации в генах BRCA1 и BRCA2. Охарактеризовано более 15000 мутаций. Носители таких мутаций имеют на 80% увеличенный риск развития рака молочной железы и/или яичника в возрасте до 60 лет Показана необходимость определения полной нуклеотидной последовательности генов или наиболее распространенных мутаций

Предрасположенность к развитию колоректального рака Sporadic (65%–85%) Familial (10%–30%) Rare CRC syndromes (<0.1%) Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) (5%) Familial adenomatous polyposis (FAP) (1%) Adapted from Burt RW et al. Prevention and Early Detection of CRC, 1996

Генетические маркеры развития рака молочной железы и яичников Полиморфизмы генов системы детоксикации организма

Значимость генотипирования в оценке эффективности проводимой терапии. Неблагоприятные лекарственные реакции (Adverse Drug Reactions – ADR) Lazarou et all. 1998. JAMA (Journal of the American Medical Association) В 1994 году в США зарегистрировано: 2,2 млн. случаев тяжелых осложнений, обусловленных неблагоприятными лекарственными реакциями от правильно назначенных препаратов Свыше 100 000 случаев со смертельным исходом 4-6 место среди причин смерти

Значимость генотипирования в оценке эффективности проводимой терапии. Фармакогеномика – наука, изучающая влияние генетических факторов на особенности реакции организма в ответ на медикаментозное воздействие

Задачи фармакогеномики Разработка оптимальных мишеней для фармакологического воздействия 90% потенциальных лекарственных препаратов отсеиваются только на этапах клинических испытаний Разработка клинических фармакогеномных тестов

Неблагоприятные лекарственные реакции (Adverse Drug Reactions – ADR) Lazarou et all. 1998. JAMA (Journal of the American Medical Association) В 1994 году в США зарегистрировано: 2,2 млн. случаев тяжелых осложнений, обусловленных неблагоприятными лекарственными реакциями Свыше 100 000 случаев со смертельным исходом 4-6 место среди причин смерти

Therapeutic Category With Drug Class Лекарства с ярко выраженной индивидуальной переносимостью (по A.Philips, JAMA 14,2001) Therapeutic Category With Drug Class Drug Cardiovascular B-blockers Atenolol, metoprolol Angiotensin-converting enzyme inhibitors Lisinporil Diuretics Furosemide, hydrochlorothiazide Calcium channel blocker Ditiazem, verapamil Inotropic agents/pressors Digoxin Analgetic Nonsteroidal anti-inflammatory drugs Aspirin, piroxicam, ibuprofen, naproxen Psychiatric Tricyclic antidepressants Impramine hydreochloride, notripthyline hydrochloride Antibiotics Penicillin Amoxicillin Antitubercular agents Isoniazid, rifampicin Macrolides Erythromycin Other Anticoagulants Warfarin sodium Corticosteroids Prednisone Anticonvulsants Carbamazepine, phenytoin Antidiabetic agents Insulin Bronchodilators Theophylline Antihistamine Meclizine hydrochloride

Основные причины неблагоприятных лекарственных реакций Ошибочное назначение препарата Качество лекарственного препарата Индивидуальная чувствительность Генетически детерминированная недостаточность или избыточность ферментов, метаболизирующих лекарственный препарат Нарушения в транспорте лекарственных препаратов и др. причины, не связанные с метаболизмом

Этапы метаболизма лекарственных препаратов Фаза I Фаза II Фаза III Цитохромы P450 Эпоксид-гидролазы Глютатион-трансферазы N-ацетил трансферазы Активация ксено-биотиков с образова- нием активных про- межуточных электро-фильных метаболитов Преобразование активных промежуточных метаболитов в водорастворимые нетоксичные компоненты Выведение водорастворимых нетоксичных компонентов из организма

Генетический полиморфизм ферментов детоксикации Фаза I Фаза II экспозиция активация детоксикация низкая высокая высокая высокая низкая высокая низкая низкая Риск развития патологии

Цитохромы человека 15 групп  001 002 003 004 005 007 008 011 017 019 021 024 026 027 051 31подгруппа:  001A 001B 002A 002B 002C 002D 002E 002F 002G 002J  003A 004A 004B 004F 005A 007A 007B 008A 008B 011A  011B 017A 019A 021A 021B 024A 026B 027A 027B 051A  051P 59 генов 001A01 001B01 002A06 002A06V2 002A07 002A07P 002A13 002B06 002B07P 002C00 002C08 002C09 002C10 002C17 002C18 002C19 002D06 002D07P 002D08P 002E01 002F01 002G01 002J02 003A03 003A04 003A05 003A05P 003A07 003A43 004A11 004B01 004F02 004F03 004F03v1 004F08 004F09P 004F10P 004F11 004F12 005A01 007A01 007B01 008A00 008B01 011A01 011B01 011B02 017A01 019A00 021A01 021A02P 021B00 024A00 026B01 027A00 027B01 051A00 051P01 051P02

Функциональная значимость Метаболизм широкого спектра эндогенных (холестерин, стероидные гормоны, простагландины) и экзогенных (лекарственные препараты, канцерогены, мутагены, аллергены, пестициды) субстратов. Развитие мультифакториальных заболеваний в следствие нарушения экспрессии и регуляции генов индифидуальных цитохромов

Полиморфизм генов цитохромов, ассоциированных с нарушенным метаболизмом ряда лекарств (по A.Philips, JAMA 14,2001)

Ассоциация лекарственных препаратов, часто вызывающих побочные реакции и полиморфизма генов детоксикации (по A.Philips, JAMA 14,2001)

CYP2C9. Биологическая значимость 18% от всей цитохромной фракции печени Катализирует ~20% CYP-зависимых лекарственных препаратов СYP2C9 – варфарин, фенитоин, лозартан, ирбесартан, толбутамид, глипизид, торсемид, ибупрофен, пироксикам, изониазид.

Варфарин Антикоагулянт непрямого действия Производное 4-гидроксикумарина Ингибирует синтез витамин-К зависимых факторов свертывания крови (факторы: VII, IX, X, II)

Варфарин: Показания Профилактика и/или лечение: Венозные тромбозы Легочная эмболия Тромбоэмболические осложнения, связанные с мерцательной аритмией и трансплантацией сердечных клапанов Инфаркт миокарда: снижение риска смерти, повторного инфаркта миокарда и случаев тромбоэмболических осложнений (инсульт, системная эмболия) Профилактика и лечение кардиогенной эмболии

Побочный эффект - кровотечение Факторы риска: Сопутствующие заболевания Применение других препаратов Нарушения дозировки Интенсивное воздействие антикоагулянта Индивидуальная чувствительность (обусловлена генетическим полиморфизмом в основном метаболизируещем ферменте – CYP2C9)

Полиморфизм гена CYP2C9 Аллельные варианты гена: CYP2C9*2 (Arg144Cys) - пониженная каталитическая активность CYP2C9*3 (Ile359Leu) – выраженная пониженная каталитическая активность Exon 3 Exon 7 CGT ATT 430 1075 Arg Ile Exon 3 Exon 7 TGT ATT 430 1075 Arg Cys Ile Exon 3 Exon 7 CGT CTT 430 1075 Arg Leu

Возможности генетической идентификации мутантных аллелей CYP2C9 *1 AvaII Ggagcattgaggaccgtgttcaagaggaagcccgc ggagcattgaggatcgtgttcaagaggaagcccgc Aggtccagagatgcattgaccttctccccaccagcc aggtccagaggtaccttgaccttctccccaccagcc *2 *1 NsiI *3 KpnI

Полиморфизм гена CYP2C9 в российской поппуляции Клиническая группа: мужчины старше 35 лет (n=186) CYP2C9 *1/*1 126 (67,7%) CYP2C9 *2/*1 30 (16,1%) CYP2C9 *2/*2 4 (2,1%) CYP2C9 *3/*1 24 (12,9%) CYP2C9 *3/*3 0 (0%) CYP2C9 *2/*3 2 (1,1 %) Частота встречаемости аллелей: CYP2C9*1 0,82 CYP2C9*2 0,11 CYP2C9*3 0,07

Выборка Генотип *1*1 *1*2 *1*3 *2*2 *2*3 *3*3 794 5.28 4,59 3,78 3.04 Полиморфизм гена CYP2C9 и терапевтическая доза (мг/сутки). C.R.Lee et all. 2002. Pharmacogenetics. Выборка Генотип *1*1 *1*2 *1*3 *2*2 *2*3 *3*3 794 5.28 4,59 3,78 3.04 3.52 0,5

Полиморфизм гена CYP2C9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. Фенитоин. Эпилепсия, постравматические состояния, нарушения мышления, болевые синдромы Показан пониженный метаболизм препарата у носителей CYP2C9*2 и CYP2C9*3 аллелей. Симптомы передозировки: атаксия, сонливость, дефицит витамина D и фолиевой кислоты

Полиморфизм гена CYP2C9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. Толбутамид Инсулинонезависимый сахарный диабет легкого и среднетяжелого течения Показан пониженный метаболизм препарата у носителей CYP2C9*3 аллелей.

Лозартан (блокада ангиотензиновых рецепторов) Полиморфизм гена CYP2C9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. Лозартан (блокада ангиотензиновых рецепторов) Артериальная гипертензия Метаболизируется в фармакологически активную форму ферментом CYP2C9 и частично CYP3A4 Показан пониженный метаболизм препарата у носителей CYP2C9*3 аллелей.

Полиморфизм гена CYP2C9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. Диклофенак, хлорпропамид, глипизид, флурбипрофен, торсемид, ирбесартан, ибупрофен Показаны CYP2C9-ассоциированные эффекты in vitro. Идут масштабные исследования in vivo

Интерпретация результатов генотипирования Плейотропность влияния генетических полиморфизмов Оценка действия факторов внешней среды Вклад индивидуальных факторов (курение, алкоголь, диета) Осуществляется разработка биоинформационной базы данных по медицински значимым генетическим полиморфизмам Достоверность Степень риска Этническая привязка

Кооперативный эффект генетических и средовых факторов, определяющих риск развития инфаркта миокарда у мужчин в возрасте до 45 лет

Результат генетического анализа. Пациент #V26. N Ген Полиморфизмы Преобладающий генотип (Европейцы) Результат анализа 1 Ангиотензин-конвертирующий фермент АСЕ Alu I/D ID 2 Аполипротеин С3 АРОС3 -482C/T СC CT 3 -455 T/C TT TC 4 3238 C/G (SstI) CC 5 Липопротеидная липаза LPL C>G Сер447Стоп 6 N291S A/G AA 7 Протромбин (Коагуляционный фактор II) F2 G-20210-A GG 8 Фактор Ляйдена (коагуляционный фактор V) F5 G-1691-A 9 Ингибитор активатора плазминогена SERPINE1 (PAI-I) –675 (4G(-675)5G). 5G/4G 10 Фибриноген FGB beta polypeptide G –455A GA 11 Тромбоцитарный рецептор фибриногена ITGB3 (GP IIIa) T –1565-C (L33P) 12 Метилентетрагидрофолатредуктаза MTHFR С-677-T (A223V) 13 Коагуляционный фактор VII F VII Arg353Gln 10976 G/A 14 Цитохром CYP2C9 (Чувствительность к варфарину) CYP2C9 R144C (CYP2C9*2) CYP2C9*1 15 L208V (CYP2C9*3)

Результат генетического анализа. Пациент #V26 (продолжение). N Ген Мутация Преобладающий генотип Результат анализа 1 ADH1B 3 exon R-47-H G/A GG 2 ALDH2 12 exon E-487-K 3 CYP2E1 5’-region -1293 to G/C 4 CYP2E17 intron 9896 C>G CC N Ген Полиморфизм Результат анализа 1 Breast cancer gene 1 BRCA1 185 delAG не обн. 2 T181G 3 4153delA 4 5382insC 5 Breast cancer gene 2 BRCA2 1528delAAAA 6 1099SX C>G 7 6174delT 8 9318delAAAA 9 CYP1A1 I462V A1506G AG 10 CYP2D6 G-A nt1 GG 11 glutathione S-transferase GSTP1 I105V G/A GA 12 A114V T/C CC 13 GSTT1 del 14 GSTM1

Медицинское генотипирование человека. Значимость: Предиктивность, индивидуальность, информативность. Оценка здоровья «здоровых» Оценка факторов риска при планировании семьи Учет индивидуальных особенностей лекарственной терапии Возможность построения принципиально новых диагностических алгоритмов

Перспективы…