Сравнительная геномика и метаболическая реконструкция бактериальных патогенов Михаил Гельфанд Институт проблем передачи информации РАН, Учебно-научный центр «Биоинформатика» XII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»

Метаболическая реконструкция Идентификация недостающих генов в полных геномах Поиск кандидатов –Анализ генов с целью предсказания общей функции: гомология функциональные подписи структурные особенности –Сравнительная геномика для предсказания специфичности: анализ регуляции позиционные кластеры слияние генов филогенетические паттерны

Как это работает: ферменты Идентификация пробелов в метаболическом пути (универсальные, таксон-специфические, в отдельных геномах) Поиск кандидатов на включение в путь: ко- локализация и ко-регуляция (во многих геномах) Предсказание общей биохимической функции по (далекому) сходству и функциональным подписям Предварительное заполнение пробела Верификация: анализ филогенетических паттернов: –отсутствие в геномах, не содержащих данного пути –дополнительное распределение с генами, имеющими ту же функцию

Как это работает: транспортёры Поиск кандидатов на включение в путь: ко- локализация и ко-регуляция (во многих геномах) Предсказание транспортной функции: анализ трансмембранных сегментов и сходство Предсказание специфичности: анализ филогенетических паттернов: –финальный продукт, если заменяет весь путь (встречается в геномах, не имеющих биосинтетического пути) –исходный продукт, если отсутствует в геномах, не содержащих пути (катаболические пути, предшественники в биосинтетических путях) –промежуточный продукт, если заменяет верхнюю или боковую часть пути

Пробел в пути биосинтеза жирных кислот у стрептококков acp P fab D accA accDaccB accC fabHfab F fab G fabZ fabI Gene fabI of Enoyl-ACP reductase (EC ) is missing in the genome 12B, and a number of Streptococci fabI (Enoyl-ACP reductase, EC ), мишень триклозана. В стрептококках: есть ферментативная активность, ген не известен

Позиционные кластеры: идентификация гена-кандидата Genome X TR? fabIhyp ? hyp TR? FRNS Genome Y Clostridium acetobutylicum TR? Streptococcus pyogenes ? hyp TR? ? fabH acpP ? fabGfabFaccAaccDaccC accB fabZ fabD fabGfabF accBfabD accAaccDaccCfabZ fabGfabFaccAaccDaccC accB fabZ fabDfabH acpP fabH acpP fabH acpP fabGfabFaccAaccDaccC accB fabZ fabD

Сайты связывания FabR (“Tr?”, HTH) HTH fabK fabH acpP fabGfabFaccAaccDaccC accB fabZ fabD Fad ( ) 1234

Метаболическая реконструкция пути биосинтеза тиамина (новые гены/функции показаны красным) thiN (confirmed) (Gram-positive bacteria) (Gram-negative bacteria) Transport of HMP Transport of HET Purine pathway

Метаболизм сахаров у стрептококков и родственных бактерий биохимические данные, ген не известен эксперимен- тальные данные биохимия + геномные предсказания только геномные предсказания

Неохарактеризованный путь у инвазивных видов S. pneumoniae S. pyogenes S. equi S. agalactiae S. suis

Структура локуса S. pyogenes, S. agalactiae S. equi S. pneumoniae TIGR4 S. suis S. pneumoniae R6

Функции генов 3-(4-deoxy-beta-D-gluc-4-enuronosyl)-N- acetyl-D-glucosamine PTS transporter hydrolase isomerase oxidoreductase dehydrogenase kinase aldolase pyruvate + D-glyceraldehyde 3-phosphate hyaluronidase (hyaluronate lyase) RegR

Потенциальный регуляторный сигнал

Структура локуса - 2 S. pyogenes, S. agalactiae S. equi S. pneumoniae TIGR4 S. suis S. pneumoniae R6

Возможная функция Путь имеется у инвазивных видов Иногда ко-локализован с геном гиалуронидазы Всегда ко-регуляруется с геном гиалуронидазы Вывод: Функция – утилизация гиалуроновой кислоты Возможно, вовлечен в патогенез

Сравнительная геномика цинковых регулонов Две основных роли цинка у бактерий: Структурная: ДНК-полимеразы, праймазы, рибосомные белки и т.д. Каталитическая: протеазы и другие ферменты

Геномы и регуляторы nZUR FUR family ??? AdcR ? MarR family pZUR FUR family

Регуляторы и сигналы nZUR-  nZUR-  AdcRpZUR TTAACYRGTTAA GATATGTTATAACATATC GAAATGTTATANTATAACATTTC GTAATGTAATAACATTAC TAAATCGTAATNATTACGATTTA

Транспортеры Ортологи известных систем AdcABC и YciC Паралоги отдельных компонентов систем AdcABC и YciC Потенциальные транспортеры с неохарактеризованной специфичностью

zinT: регуляция zinT is isolated fusion: adcA-zinT E. coli, S. typhi, K. pneumoniaeGamma-proteobacteria Alpha-proteobacteria B. subtilis, S. aureus S. pneumoniae, S. mutans, S. pyogenes, L. lactis, E. faecalis Bacillus group Streptococcus group zinT is regulated by zinc repressors (nZUR- , nZUR- , pZUR) adcA-zinT is regulated by zinc repressors (pZUR, AdcR) (ex. L.l.) A. tumefaciens, R. sphaeroides

ZinT: анализ белковой последовательности E. coli, S. typhi, K. pneumoniae, A. tumefaciens, R. sphaeroides, B. subtilis L. lactis Y. pestis, V. cholerae, B. halodurans TMZnAdcA S. aureus, E. faecalis, S. pneumoniae, S. mutans, S. pyogenes ZinT

ZinT: сводка zinT иногда слит с геном компоненты цинкового транспортёра adcA zinT экспрессируется только при недостатке цинка ZinT находится на поверхности клетки (имеет трансмембранный сегмент) ZinT имеет цинк-связывающий домен ZinT: вывод ZinT – это новый тип цинк-связывающей компоненты цинкового ABC-транспортёра

Цинковая регуляция генов, кодирующих PHT-белки (pneumococcal histidine triad) у стрептококков S. pneumoniae S. equi S. agalactiae lmbphtDphtE phtBphtA lmbphtD S. pyogenes phtY lmbphtD zinc regulation shown in experiment

Структурные особенности PHТ-белков PHT-белки содержат множественные мотивы HxxHxH PHT-белки S. pneumoniae - паралоги (65- 95% тождество) Sec-зависимая гидрофобная лидерная последовательнсть на N-концах Локализация PHT-белков S. pneumoniae на поверхности бактериальной клетки была показана экспериментально

PHТ-белки: сводка PHT-белки экспрессируются при недостатке цинка PHT-белки локализованы на поверхности клетки PHT-белки имеют цинк-связывающие мотивы Гипотеза: PHT-белки – это новый класс бактериальных транспортёров цинка

… неверно  Цинк-связывающие домены в транспортёрах цинка: EEEHEEHDHGEHEHSH HSHEEHGHEEDDHDHSH EEHGHEEDDHHHHHDED DEHGEGHEEEHGHEH (гистидин-аспартат- глютамат) Гистидиновые триады у стрептококков: HGDHYHY 7 out of 21 HGDHYHF 2 out of 21 HGNHYHF 2 out of 21 HYDHYHN 2 out of 21 HMTHSHW 2 out of 21 (специфический паттерн гистидинов и ароматических аминокислот)

Анализ PHТ-белков (продолжение) Ген phtD водит в один оперон с геном lmb во всех геномах стрептококков –Lmb: адгезин, участвующий в связывании ламинина и вторжении стрептококков в эпителиальные клетки PhtY из S. pyogenes: –phtY регулируется AdcR –PhtY состоит из трёх доменов: PHTinternalinH-rich 4 HIS TRIADS LRR IR HDYNHNHTYEDEEGH AHEHRDKDDHDHEHED

PHТ-белки: сводка-2 PHT-белки индуцируются недостатком цинка PHT-белки локализованы на поверхности клетки PHT-белки имеют структурные цинк-связывающие мотивы phtD образует оперон с геном адгезина PhtY содержит домен интерналина, отвечающие за инвазию стрептококков Гипотеза PHT-белки – это адгезины, участвующие в прикреплении стрептококков к эпителиальным клеткам, что приводит к инвазии

цинк и паралоги рибосомных белков L36L33L31S14 E. coli, S.typhi ––– +– K. pneumoniae ––– – Y. pestis,V. cholerae –  –– +– B subtilis –– + –– + S. aureus –– – ––– + Listeria spp. –– –– + E. faecalis – –  – – –– + – S. pne., S. mutans –– – ––– S. pyo., L. lactis –– – ––– + nZUR pZUR AdcR

Мотив «цинковая лента» (Makarova-Ponomarev-Koonin, 2001) L36L33L31S14 E. coli, S.typhi (–)–(–) +– K. pneumoniae (–)–(–) –– Y. pestis,V. cholerae (–)  –(–) +– B subtilis (–)(–) + –(–) + S. aureus (–)(–) – ––(–) + Listeria spp. (–)(–) ––(–) + E. faecalis (–) (–)  – – –(–) + – S. pne., S. mutans (–)(–) – ––(–) S. pyo., L. lactis (–)(–) – ––(–) + nZUR pZUR AdcR

Сводка наблюдений: Makarova-Ponomarev-Koonin, 2001: –L36, L33, L31, S14 – единственные белки, имеющие паралогов в нескольких видах –L36, L33, L31, S14 – это четыре из семи белков, имеющих мотив «цинковая лента» (четыре цистеина) –Одна из двух (или более) копий белков L36, L33, L31, S14 обычно содержит мотив «цинковая лента», а остальные – нет Среди генов, кодирующих паралоги рибосомных белков, (почти) всегда один ргулируется цинковым репрессором, а кодируемый им белок никогда не содержит «цинковой ленты»

Плохой сценарий достаточно цинка недостаточно цинка: весь цинк использован рибосомами, не хватает цинка для ферментов

Регуляторный механизм ribosomes Zn-dependent enzymes R Sufficient Zn Zn starvation R repressor

Хороший сценарий достаточно цинка недостаточно цинка: некоторые рибосомы содержат паралоги без цинка, остаётся цинк для ферментов

Предсказание … (Proc Natl Acad Sci U S A Aug 19;100(17): ) … и подтверждение (Mol Microbiol Apr;52(1): )

Андрей Миронов Анна Герасимова Ольга Калинина Алексей Казаков (гиалуронат) Екатерина Котельникова Галина Ковалёва Павел Новичков Ольга Лайкова (гиалуронат) Екатерина Панина (цинк) (сейчас в UCLA, USA) Елизавета Пермина Дмитрий Равчеев А.Б.Рахманинова Дмитрий Родионов (тиамин) Алексей Витрещак (тиамин) (сейчас LORIA, France) Howard Hughes Medical Institute Ludwig Institute of Cancer Research РФФИ РАН (программа «Молекулярная и клеточная биология») Андрей Остерман (Burnham Institute, San-Diego, USA) (жирные кислоты)