Mast Cell Tryptase Controls Paracellular Permeability of the Intestine 生科四甲 陳子甯

作者假設： mast cells signal to colonocytes by release of tryptase and activation of PAR2, and that PAR2 couples to ERK1/2 by a βARR- dependent mechanism to regulate TJs. ERK1/2 ： extracellular signal-regulated kinases 1/2 arrestin βARR:β-arrestin TJ: tight junction

作者目標： 證實 PAR2 的活化造成 TJs 和細胞膜滲透性的改變。 證實 mast cell 藉由分泌 tryptase 來活化 PAR2 ，造成 colonocytes 細胞 內鈣離子濃度上升及細胞膜滲透性提高。. 證實 ERK1/2 及 βARR 在 PAR2 活化的這個機制中，扮演何種角色 ERK1/2 ： extracellular signal-regulated kinases 1/2 arrestin βARR:β-arrestin

Mast cell:

Model for β-arrestin-dependent activation of ERK1/2 by PAR2 microtubule-associated proteins (MAPs) phospholipase A2 (PLA2) Ca 2+

FIG. 1. Expression of mRNA encoding PAR2 and trypsinogen IV by colonocytes. 525bp 400bp 525bp 400bp c p c T c p cT 確認 NCM460 和 T84 這兩株小腸表皮細胞都能夠表現 PAR2 和 trypsinogenIV NCM460 和 T84 都是種小腸表皮細胞

FIG. 2. PAR2-mediated mobilization of [Ca 2+ ] i in colonocytes. AP: 由六個 AA 組成 -SLIGKV RP: 是 AP 序列相反的 peptide-VKGILS 。用來當 做 control 組。 結論：如果細胞外無鈣離子，細 胞仍可利用本身所儲存的鈣離子 來進行訊號傳遞。

FIG. 3. PAR2-mediated mobilization of [Ca 2+ ] i in colonocytes. 結論： trypsin 活化 PAR2 後，的確會讓細胞體內的鈣離子增加。 而 trypsin 的確對 PAR2 有專一性。 c

FIG. 4. Characterization of CHMC. 確認 mast cell 與 IgE binding 後，可促進 degranuled 。 測不同型態的 CHMC 的 螢光強度。 CHMC 是種 mast cell SBTI: Soybean trypsin inhibitor 證實 mast cell 分泌 tryptase 的方式是 degranule 。

Flow Cytometry

FIG. 5. Mast cell signaling to colonocytes. 48/80 ：是種促使 mast cell degranule 的藥物。 證實 mast cell 的確是用 degranule 的方式將 tryptase 送至 supernatant form 中，傳至 colonocytes

TER ( transepithelial resistance ) & paracellular permeability

FIG. 6. Effects of PAR2 agonists on paracellular permeability. 證實 PAR2 Activation Increases Paracellular Permeability HRP 是種位於細胞質中的酵素。

ZO-1 與 E-cadhesin Apical Basal Zo-1 E-cadhesin

FIG. 7. PAR2-induced redistribution of TJ proteins and F-actin detected by microscopy ZO-1 Claudin-1 F-actin occludin Isotype 證實了 PAR2 的確會讓 TJ protein 和 F-actin redistribution 。

FIG. 8. PAR2-induced redistribution of TJ proteins detected by subcellular fractionation and Western blotting. 結論： PAR2 的確 會造成 TJ proteins 的 redistribution E-cadherin is a transmembrane glycoprotein that mediates epithelial cell-to-cell adhesion.

FIG. 9. Effects of mast cell products on paracellular permeability. 證實了 PAR2 的確會改變 paracellular permeability

FIG. 10. ERK1/2-mediated changes in paracellular permeability. ERK1/2 可以調控 paracellular permeability ， 而 PAR2 可以調控 ERK1/2 ，所以 PAR2 與調 控 paracellular permeability 有關。 UO126 ：是種抑制 ERK1/2 磷酸化的藥劑。

FIG. 11. Down-regulation of βARR using siRNA βARR1 βARR2 498bp 381bp βARR 是種 cytoplasm-nucleus messenger ， 會與 PAR2 結合，活化 ERK1/2 證實： βARR 會活化 ERK1/2

FIG. 12. βARR-mediated changes in paracellular permeability. Oligofectamine 可促進 βARR 與 ERK1/2 binding 的一種藥劑。 證實 PAR2 活化後，使 βARR 促進 ERK1/2 活化， 進而改變 colonocytes 的滲透性。

Conclusion Colonocytes expressed PAR2 mRNA and responded to PAR2 agonists with increased [Ca 2+ ] i Mast cells signal to colonocytes in a paracrine manner by release of tryptase and activation of PAR2. βARR 促進 ERK1/2 的活化，導致 colonocytes 的 permeability 上升