1 Использование нанотехнологических подходов для разработки нового поколения вакцин и терапевтических препаратов А.Л.Гинцбург ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН

2 Артриты Гастрит, язва желудка Обструктивные легочные заболевания Сердечно-сосудистые заболевания Хр.заболевания печени Онкологические заболевания Оптимистические прогнозы середины прошлого столетия в отношении борьбы с инфекциями не оправдались. По данным воз ежегодно в мире от инфекционных болезней умирает 16 млн человек. За последние десятилетия человечество столкнулось с десятком новых инфекционных заболеваний. В основе многих тяжелых хронических заболеваний, которые ранее считались соматическими, лежит инфицирование определенным патогенным микроорганизмом.

3 В то же время, как показали два прошедших столетия, самым надежным способом защиты человеческой популяции от инфекций это вакцинация. Вакцины созданы против 34 возбудителей инфекционных заболеваний, а человечество поражает более 400 инфекций. Последние достижения иммунологии и микробиологии с конструктивными возможностями био и нанотехнологий дают возможность приступить к созданию вакцин против тех возбудителей инфекционных заболеваний, для которых они еще не созданы и к принципиальному улучшению качества существующих вакцин.

4 Структурная организация аденовирусной частицы Фибер ДНК Гексон Ген чужеродного антигена нм - Содержит делетированный геном, неспособен к размножению in vitro и in vivo. - Представляет собой физическую самособирающуюся частицу. - Обеспечивает доставку и экспрессию чужеродного генетического материала в клетке. Для решения этих проблем в НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН разработан ряд технологий. Сегодня остановимся на одной, которая дала к настоящему времени наиболее значимые результаты, позволяющие в ряде случаев приступить к клиническим испытаниям. Для этого генно- инженерными методами на основе аденовирусов были сконструированы частицы способные доставлять нужные гены (определяющие синтез полезных белков) в строго определенные клетки и ткани организма человека.

5 участок молекулы белка оболочки нановирусной частицы, в котором возможно проведение модификаций Выявление участка белка оболочки нановирусной частицы позволяющий проведение различных модификаций Суперкомпьютер Полученные результаты опубликованы в журнале: Journal of Virology, v.-81, pp.-9641–9652 Logunov D.Y., Zubkova O.V., Karyagina-Zhulina A.S., Shmarov M.M., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Identification of HI-like loop in celo adenovirus fiber for incorporation of receptor binding motifs. белок оболочки нановирусной частицы Сотрудниками нашего института были проведены биоинформационные исследования с использованием российского суперкомпьютера и уникального программного обеспечения для выявления участка оболочки вирусной частицы, позволяющего проводить модификации без нарушения общей структуры частицы. В результате математически рассчитанной модификации была изменена специфичность проникновения. Если исходный вирус проникал в эпителиальные клетки, то созданный нами - в клетки мышцы (фибробласты).

6 На основе сконструированного носителя созданы терапевтические и профилактические препараты ген фактора роста эндотелия ген Н 5 ген гликопротеина 1 2 3

7 Аденовирусные частицы содержат гены ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов для лечения хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей человека Препараты для генной терапии, разработанные в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН Вестник Российской АМН, 2006, №9-10, С Н.П. Бочков, Б.А. Константинов, А.В. Гавриленко, В.З. Тарантул, Е.Д. Свердлов, Б.С. Народицкий, А.Л. Гинцбург. Генно-инженерные технологии в лечении хронической ишемии нижних конечностей. Препарат создан совместно с Российским научным центром хирургии РАМН; Начаты клинические испытания препарата на базе Российского научного центра хирургии РАМН; Результаты работ опубликованы и запатентованы.

8 Кандидатная вирусная вакцина против вируса гриппа птиц H5N1 Кандидатная вирусная вакцина против вируса гриппа птиц H5N1 Кандидатные аденовирусные вакцины разработанные в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН Разработана и испытывается совместно с ФГУ “Федеральный центр охраны здоровья животных”, г. Владимир; Эффективность кандидатной нановирусной вакцины против вируса гриппа птиц H5N1 в опытах на животных достигает 95%; Разработанная технология получения вакцин позволяют, в случае появления нового эндемичного штамма вируса гриппа, создать адекватный вариант вакцины в течении дней; Разработанная технология получения нановирусных вакцин запатентована.

9 Кандидатная вакцина против вируса бешенства Кандидатная вакцина против вируса бешенства Кандидатные аденовирусные вакцины разработанные в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН В лабораторных исследованиях эффективность вакцины для животных против вируса бешенства составила 95-98%; Кандидатная нановирусная вакцина подготовлена для полевых испытаний на базе ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН, г. Покров Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2006, №4, С М.М. Шмаров, И.Л. Тутыхина, С.Ж. Цыбанов, Б.В. Новиков, Б.С. Народицкий, А.Л. Гинцбург Индукция проективного иммунного ответа у мышей, вакцинированных рекомбинантным аденовирусом птиц CELO, экспрессирующим гликопротеин G вируса бешенства.

10 Технологическая схема получения препаратов (терапевтических и профилактических) на основе аденовирусных частиц Готовый терапевтический или профилактический препарат Максимальная производительность технологической линии, занимающей 300 м 2 составляет доз препарата нановирусных частиц в год. Этап 5 Получение нановирусного посевного материала Накопление нановирусных частиц в культуре клеток Очистка и концентрирование полученного препарата с помощью проточной хроматографии Этап 1 Этап 2 Этап 3 Этап 4 Контроль качества препарата

11 Требования к “идеальной” субъединичной вакцине Для полноценного иммунного ответа на субъединичный АГ (а только такие вакцины могут полностью гарантировать безопасность на фоне массовых иммунодефицитных состояний (разного генеза) необходимо выполнить ряд условий: 1) Вакцина должна содержать АГ взаимодействующий с Toll-подобными рецепторами (стимулирующими врожденный иммунитет). 2) Вакцина должна содержать АГ специфичный для конкретного патогена (стимулировать приобретенный иммунитет). 3) АГ должен быть определенным образом представлен в составе нанометрового носителя, чтобы гарантировать кластаризацию рецепторов АГ. Второй подход подразумевает создание идеальной субъединичной вакцины. Здесь перечислены требования к такой вакцине, исходя из уровня наших знаний по иммунологии и микробиологии. Препарат должен содержать два типа лигандов взаимодействующих с двумя типами рецепторов, находящихся на клетках иммунной системы. Взаимодействие с первым типом рецепторов активирует врожденный иммунитет (то, что в быту мы называем воспалением). Взаимодействие со вторым типом рецепторов активирует приобретенный иммунитет.

12 Лиганд Рецептор MyD88 FADD NFKB Активация генов Toll Оба типа клеточных рецепторов обеспечивают запуск иммунного ответа только после их кластаризации, вызванной взаимодействием лиганда и рецептора. Лиганд является частью антигена. В связи с этим становится очевидным, что геометрия расположения лигандов для клеточных рецепторов является определяющим моментом для кластаризации и получения полноценного иммунного ответа. Toll p65 p50 Toll АГ

13 Cm4 Cm3 Cm2 Cm1 VH CL VL L H H L mlgM CαCαCβCβ VαVα CβCβ αβ Другой тип рецепторов, который возник, по-видимому, на более поздних стадиях эволюции предназначен для узнавания уникальных (неконсервативных) особенностей микроба – это антигенные рецепторы Т и В клеток, обеспечивающих весь комплекс приобретенных иммунных реакций. антигенраспознающий рецептор антигенраспознающий рецептор CD4+ В-лимфоцитыТ-лимфоциты

14 Специфичность Толл-подобных рецепторов (TLRs)‏ TLR6 TLR2 TLR1 TLR5 TLR11 TLR9 TLR3 TLR7TLR8 TLR10 TLR4 CD14 Липопротеины Липоарабидоманнан Липотейхоевые кислоты Зимозан (дрожжи)‏ ЛПС Флагеллин T.gondi Профилин Немети- лирован- ная CpG ДНК дцРНК оцРНК ? ? Бактериальные компонентыВирусные компонентыНеизвестные компоненты Решая задачу распознавания и защиты от патогенов, эволюция многоклеточных создала молекулы- рецепторы, способные узнавать консервативные признаки всех классов микроорганизмов. Эти рецепторы, о существовании которых стало известно лишь 10 лет назад, называются Toll-подобными. С помощью 11 типов Toll рецепторов клетки иммунной системы, в первую очередь, профессиональные фагоциты узнают консервативные компоненты практически всех микроорганизмов, в более общей форме полимеры органического происхождения чужеродные для многоклеточного организма. Лиганд-рецепторное взаимодействие запускает весь комплекс реакций врожденного иммунитета.

15 Реализация основного принципа нанотехнологии - самосборка биологически активных наноструктур с заданными свойствами Как можно в настоящее время выполнить эти требования. Их можно выполнить, реализуя основной принцип наноконструирования, позаимствованный у эволюции – принцип комплементарности, позволяющий осуществлять самосборку, причем в промышленных масштабах.

16 Для реализации этого принципа в НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН в лаборатории биологически активных наноструктур был разработан метод, позволяющий совмещать в одной частице все компоненты, определяющие оптимальные свойства нановакцин. Каждый компонент наделяется способностью к самосборке на биосовместимом (а в дальнейшем на биодеградируемом) носителе, за счет введения в его состав карбогидрат-связывающего домена из гликолитических гидролаз, которые имеются у многих сапрофитных бактерий, способных утилизировать хитин, целлюлозу, липополисахариды.

17 Исследование ферментативного аппарата, ответственного за деградацию этих полимеров показало, что он высокоорганизован и представлен структурами, получившими название целлюлозосомы. В состав целлюлозосомы в первую очередь входит высокомолекулярный белок, выполняющий структурные функции. Структурный белок имеет сайт связывания для белков с ферментативными активностями, которые способны образовывать на поверхности бактериальной клетки ферментативный конвейер, состоящий из различных ферментов, осуществляющих деградацию полимера. Причем, в состав одной целлюлозосомы могут входить ферменты, синтезируемые разными видами бактерий, живущих в одной многокомпонентной природной нише. Это прекрасный пример социального поведения бактерий на протеомном уровне, а также пример того, как можно получать глюкозу или низкоатомные спирты (энергетически ценные продукты) используя нанатехнологии. Но сегодня нас в первую очередь будет интересовать другая структурная особенность целлюлозосом, а именно их домены, способные высокоспецифично связывать целлюлозу.

18 C N 5’ 3’ Трехмерная структура ЦСД и ГСД В настоящее время генетическая организация ряда белков, содержащих целлюло- и гликанозосвязывающие домены известна. Фактически сама природа в процессе эволюции сделала все необходимое для того, чтобы была возможность использовать эти домены в составе гибридных белков. На 5’ и 3’ концах ДНК-фрагмента, кодирующего домен, имеются спейсерные последовательности, соответствующие С- и N-концевой частям белкового фрагмента, присоединение к которым, как было показано нами, не влияет на целлюлозо- и гликаносвязывающую способность.

19 Схема конструирования рекомбинантной плазмиды GBD-D5. Это позволило клонировать фрагменты ДНК, содержащие ЦСД и ГСД и получить слитные генетические конструкции, детерминирующие синтез ЦСД или ГСД и протективных АГ в качестве которых в одном случае выступал белок ESA-6 туберкулеза, в другом трансмембранный белок туляремии tyl-4, и мембраносвязанный поверхностный белок адгезии возбудителя лептоспирозов. D-5 GBD GBD- D-5 GBP антиген

20 Гибридный белок ЦСД Tul-4 можно получить электрофоретически чистым в одну стадию на колонке с целлюлозой. При этом он сохраняет свои антигенные свойства по результатам иммуноблотинга Ошаренная целлюлоза лизат Электрофоре- тически чистый гибридный белок ЦСД Tul – лизат F.tularensis PACYCFNL Tul-4 2 – белок ЦСД Tul-4 1 – лизат F.tularensis 2 – лизат F.tularensis PACYFNL Tul-4 3 – белок ЦСД Tul В настоящее время проводится работа по изучению протективных свойств гибридного белка. Далее была проведена работа по очистке рекомбинантного белка, содержащего tyl-4 ЦСД на колонке с ошаренной целлюлозой. Как видно из данных, представленных на этом слайде, гибридный белок tyl-4-ЦСД можно получить электрофоретически чистым в одну стадию на колонке с целлюлозой. При этом он сохраняет свои антигенные свойства по результатам иммуноблотинга.

21 Такие гибридные белки были использованы для сборки субъединичных конструкций, приближающих нас к созданию "идеальной вакцины". Для этого на носителе наноразмером ( ), представляющего собой гликан,полученный из дрожжей (в отдельных опытах было показано, что гликан активируюет Toll рецепторы) был иммобилизован с помощью гликаносвязывающего домена антиген лептоспир. Схема иммобилизации химерного белка GBD-D5 на полисахариде. химерный белок гликан

22 Иммуногенные свойства такой конструкции изучали, исследуя циокиновый профиль, иммунизированных животных с помощью жидких биочипов в варианте биоплекса и, определяя уровень АТ к лептоспирозному АГ. Полученные результаты сравнивали с такими же характеристиками, полученными при иммунизации лептоспирозной инактивированной вакциной и в результате лептоспирозной инфекции. Нановакцина значительно усиливает (в 5-6 раз) синтез ИЛ-1 альфа в первые 2-3 суток, что говорит об усилении функциональной активности моноцитов и макрофагов. Резкое увеличение количества ИЛ-4 и 10 говорит об увеличении активности Т- хелперов 2-го типа. Многократно увеличивается количество антител к лептоспирозному АГ. вакцины.

23 Таким образом, в настоящее время мы располагаем рядом технологий, аналогичных тем, что заложены в конструкторе "Лего", позволяющим создавать различные комбинации наноконструкций, пригодных для поиска наиболее эффективной на пути создания субъединичной вакцины.

24 Сдерживающим моментом здесь, как и в большинстве наноразработок, имеющих отношение к медицине является отсутствие биосовестимых и биодеградируемых наноматериалов, как для создания иммунобиологических препаратов, так и мишень-ориентированной доставки лекарства, всех видов протезирования и т.п. Эту проблему нанобиологического материаловедения с нашей точки зрения необходимо выделить в отдельную подпрограмму в рамках нанотехнологического проекта в стране.