第三节 Oxidative phosphorylation

一. 氧化磷酸化的机理 What is oxidative phosphorylation 氧化磷酸化（ oxidative phosphorylation ） 是指细胞内伴随有机物氧化，利用生物氧化 过程中释放的自由能，促使 ADP 与无机磷酸 结合生成 ATP 的过程。 ？

一. 氧化磷酸化的机理 20 世纪 30 年代包括德国生物化学家、诺贝尔 奖获得者 Meyerhof & Warburg 在内的许多生化 学家对代谢过程中能量的产生和利用作了深入研 究，发现无论在糖酵解或三羧酸循环等代谢过程 中，都有伴随着 ATP 磷酸根的放出或 ADP 得到磷 酸根的变化这类化学能量高效率的传递方式，指 出腺苷三磷酸（ ATP ）是代谢中能量产生和利用 的关键化合物。

一. 氧化磷酸化的机理 1941 年 Fritz Lipmann 引入 “ 高能磷酸键 ( ～ P)” 的 概念。 1949 年美国生化学家 Eugene Kennedy 和 Albert Lehninger 发现线粒体含有三羧酸循环和呼吸 链所需要的全部酶系统，并且发现生物氧化与 ADP 磷 酸化相偶联构成了氧化磷酸化。但是， NADH 的氧化 和电子传递过程是如何与 ADP 磷酸化生成 ATP 反应偶 联起来一直不清楚。

一. 氧化磷酸化的机理 关于这一问题目前至少有三种假说 比较著名的假说有三个： 化学偶联假说 构象偶联假说 化学渗透学说 目前得到公认的是 “ 化学渗透学说 ” 。

这个假说是 1953 年由 Edward Slater 最先提出。 假说认为在 NADH 氧化和电子传递过程中产生了一种 活泼的高能共价中间物，通过此中间物进一步氧化产 生的能量来驱动 ATP 的合成。这一假说完全是依据底物 水平磷酸化机理提出的，例如在糖酵解中，由 3- 磷酸 甘油醛脱氢酶催化的反应就产生了一种活泼且具有高 能磷酸基转移势能的酰基磷酸化合物 1 ， 3- 二磷酸甘油 ，随后其分子中的高能磷酸基团在磷酸甘油酸激酶的 作用下被转移到 ADP 生成 ATP 。虽然在糖酵解过程中存 在这种例证，但是人们至今未能在线粒体中分离到与 之相类似的高能共价中间物。 化学偶联假说 Chemical coupling hypothesis

这个假说是 1964 年由 P.D.Boyer 提出。该假说认为 作为电子传递体的蛋白质有两种不同的构象：低能构 象和高能构象。电子传递的结果使低能构象转变为高 能构象，后者再将能量传递给 F 0 -F 1 -ATP 合成酶，使 之也发生构象变化，从而推动 ADP 磷酸化形成 ATP 。这 种假说有一定的实验根据，在电子沿呼吸链流动时， 观察到线粒体内膜发生迅速的物理变化，但由于测定 构象比较困难，支持这个假说的实验太少。 构象偶联假说 Conformational coupling hypothesis

英国生物化学家 Peter D Mitchell 在 1961 年提出 化学渗透假说，由于该假说提出后逐渐拥有越来越 多的实验证据，因而成为目前解释氧化磷酸化偶联 机理最为公认的一种假说，并且 Peter Mitchell 因 提出该假说而获得了 1978 年的诺贝尔化学奖。 化学渗透学说 Chemiosmotic hypothesis

 电子传递体在线粒体内膜上有着不对称分布，传氢 体和传电子体交替排列，催化是定向的； Chemiosmotic hypothesis—key points

一. 氧化磷酸化的机理  复合物 I 、 III 、 IV 将 H + 从基质内泵向内膜的外侧 ，而将电子传向其后的电子传递体； 化学渗透学说

一. 氧化磷酸化的机理  内膜对质子不 具有通透性， 这样在内膜两 侧形成质子浓 度梯度，这就 是推动 ATP 合 成的原动力； 化学渗透学说

一. 氧化磷酸化的机理  当存在足够高的跨膜质子化学梯度时，强大的质子 流通过 F 1 -F 0 -ATPase 进入基质时，释放的自由能 推动 ATP 合成。 化学渗透学说

一. 氧化磷酸化的机理 The reconstituted vesicles containing ATP synthase and bacteriorhodopsin, a light-driven proton pump, reported by Efraim Racker and Walther Stoeckenius in 1974 化学渗透学说

(min) A ,06 -0,04 -0,02 0,00 0,02 ATP Gramicidin AO ADP + P AO H + AOH + ATP i

一. 氧化磷酸化的机理 F 1 ：球形头部，伸入 线粒体基质，由五种亚 基组成  3  3   , 是 ATP 合酶的催化部分； F 0 : 横贯线粒体内膜 ，含有质子通道，由十 多种亚基组成。位于 F 1 与 F 0 之间的柄含有寡霉 素敏感性蛋白。 F 1 -F 0 -ATPase 复合物

一. 氧化磷酸化的机理 由上述化学渗透假说可知，该模型必需具备两个 条件：一是线粒体内膜必须是质子不能透过的封闭 系统，否则质子梯度将不复存在；二是要求呼吸链 和 ATP 合酶在线粒体内膜中定向地组织在一起，并 定向地传递质子、电子和进行氧化磷酸化反应。 重 要重 要

一. 氧化磷酸化的机理 目前这两方面都获得了一些实验证据，例如能携带 质子穿过线粒体内膜的物质（如 2,4- 二硝基苯酚） 可破坏线粒体内膜对质子的透性壁垒，使质子电化学 梯度消失。 另外根据测算，膜间隙的 pH 较内膜低 1.4 个单位 ，并且线粒体内膜两侧原有的外正内负跨膜电位升高 。 重 要重 要

一. 氧化磷酸化的机理 F1-F0-ATPase 复合物

P/O( 磷氧比 ) ：在生物氧化过程中，伴随 ADP 磷酸化所消耗的无机磷酸的磷原子数与消 耗的分子氧的氧原子数之比。即每消耗 1 个氧 原子所产生的 ATP 的分子数。 二. 氧化磷酸化的 P/O 比

测定结果表明： NADH 经呼吸链完全氧化时， P/O 为 3 ，即 1 分子的 NADH 通过呼吸链将电子最终传递给 O 2 可产生 3 个 ATP ； 二. 氧化磷酸化的 P/O 比

FADH 2 经呼吸链完全氧化时， P/O 为 2 ，即 1 分子的 FADH 2 通过呼吸链将电子最终传递给 O 2 可产生 2 个 ATP 。 为什么？

二. 氧化磷酸化的 P/O 比 为什么？

二. 氧化磷酸化的 P/O 比 但是, 近年来很多实验结果都证明，以 NADH 作为 电子供体时，测得的 P/O 比值大于 2 。以琥珀酸作为电 子供体时，侧得的 P/O 比值大于 1 ；所以 P/O 比值不一 定是整数。例如，  - 羟丁酸经过 NADH 途径的 P/O 比 值为 2.4~2.6 ，产生的 ATP 数目为 2.5 ；而琥珀酸经过 FADH 2 的 P/O 比值为 1.7 ，产生的 ATP 数目为 1.5 。

二. 氧化磷酸化的 P/O 比 因此，虽然电子转移伴随着 ATP 的合成，但不能 仅以 P/O 比值作为 ATP 生成数的依据，而应考虑一对 电子从 NADH 或 FADH 2 传递到氧的过程中，有多少质 子从线粒体基质泵出，以及有多少质子必须通过 ATP 合酶返回基质以用于 ATP 的合成，这样才能从本质上 确定 ATP 的生成数量。

二. 氧化磷酸化的 P/O 比 目前被广泛接受的观点是： ATP 、 ADP 和无机磷酸 通过线粒体内膜的转运是由 ATP-ADP 载体和磷酸转位 酶催化的。已知每合成 1 个 ATP 需要 3 个质子通过 ATP 合酶。与此同时，把一个 ATP 分子从线粒体基质转运 到胞液需要消耗 1 个质子，所以每形成 1 个分子的 ATP 就需要 4 个质子的流动。因此，如果一对电子通过 NADH 电子传递链可泵出 10 个质子，则可形成 2.5 个 分子 ATP ；如果一对电子通过 FADH 2 电子传递链有 6 个质子泵出，则可形成 1.5 个 ATP 分子。

三. ATP 酶 - 构象偶联假说 该假说是 1964 年由美国生物化学家 Paul Boyer 最 先提出，他认为电子传递过程中，线粒体内膜上的蛋 白质组分发生了构象变化，转变成一种高能形态。这 种高能形态通过将能量转移到 ADP 合成 ATP 后，又得 以恢复其原来的构象。随着人们对 ATP 合酶结构的研 究和认识不断深入，在构象偶联假说的基础上形成了 ATP 合酶结合变化和旋转催化假说。

三. ATP 酶 - 构象偶联假说 ATP 合酶结合变化和旋转催化假说认为， ATP 合酶 与底物核苷酸的作用是按照结合变化机理进行的。构 成 ATP 合酶头部的 α 3 β 3 亚基构成 3 个催化部位，中部的 γε 亚基在质子推动力的驱动下相对于 α 3 β 3 作旋转运动 。由于 3 个 β 亚基与 γε 亚基的不对称接触，使其分别处 于三种不同的状态，即无核苷酸结合的空置状态（ O ）、结合 ADP+Pi 的松散结合状态（ L ）和结合 ATP 的 紧密结合状态（ T ）。

Rotation of  leads to sequential binding changes for each  subunit.

三. ATP 酶 - 构象偶联假说 当质子推动力驱使 H + 经 F 0 质子通道进入时， F 0 组分 质子化而发生构象改变，积累足够的扭矩力，推动 γε 相对 α 3 β 3 旋转 120° ，使处于 T 态的催化部位释放 ATP 变成 O 态，同时 L 态催化部位上生成 ATP 变为 T 态， O 态结合 ADP+Pi 变为 L 态

   Boyer

The binding-change model was elegantly supported by two other experimental observations X-ray crystallography revealed that the three  subunits of F 1 assumes three different conformations, with bound ADP, ATP analog, or empty respectively. Rotations of the  subunit and the c -ring of the F 1 unit in three discrete steps of 120 o (as being powered by ATP hydrolysis catalyzed by the  subunits) have been directly observed using fluorescence microscopy (1997)

Rod-shaped  subunit. ADP App(NH)p Empty Structure determination indicates that indeed the three  subunits are inequivalent in conformation! (John Walker, 1994) T (tight) L (loose) O (open)

Rotation of the  subunit and the ring of c subunits in the F o F 1 complex was observed by in vitro studies using fluorescence microscopy (K. Kinosita, 1997)  3  3 , with the  subunit linked to an actin filament will also rotate when ATP is added. Fluorescencetly labeled The world’s smallest molecular motor: rotational catalysis.

Model on the rotation of the c-ring in ATP synthase: two half-channels for H + on the a subunit has been proposed. (3ATP made per protons transported: ~3H + /ATP.) Asp

1. 解偶联剂 解偶联剂（ uncoupler ）是指那些不阻断呼吸链的电子 传递，但能抑制 ADP 通过磷酸化作用转化为 ATP 的化合 物。它们也被称为氧化磷酸化解偶联剂。 最早发现的一个解偶联剂是 2, 4- 二硝基苯酚（ 2, 4-dinitrophenol, DNP ），它是一种弱酸性亲脂化合物 ，在 pH7 条件下， DNP 以解离形式存在，不能通过线粒 体内膜。但是在酸性环境中， DNP 转变为脂溶性的非解 离形式，可携带质子透过线粒体内膜。这样就破坏了电 子传递形成的跨膜质子电化学梯度 四、氧化磷酸化的抑制

1. 解偶联剂 在解偶联剂存在时，电子沿呼吸链的传递能正常进 行，但不能偶联产生 ATP ，这样就使电子传递所产生 的自由能以热能的形式被消耗。由于 DNP 解偶联剂 只专一性地抑制与呼吸链相偶联的 ATP 的形成过程， 因此，它不会影响底物水平的磷酸化。 四、氧化磷酸化的抑制

这类化合物直接作用于 ATP 合酶复合体，从而抑 制 ATP 的合成。 它们使膜外质子不能通过 ATP 合酶复合体返回膜 内，使膜内质子继续泵出到膜外显然越来越困难， 最后不得不停止，所以这类抑制剂间接抑制了电子 传递和分子氧的消耗。 寡霉素 属于此类抑制剂，它与 F 0 的一个亚基结 合而抑制 F 1 。 2. 氧化磷酸化抑制剂 四、氧化磷酸化的抑制

3. 离子载体抑制剂 离子载体抑制剂（ ionophore ）是指那些能与某种离子 结合，并作为这些离子的载体携带离子穿过线粒体内膜的 脂双层进入线粒体的化合物。 这类抑制剂均是脂溶性物质，它们与解偶联剂的区别 在于它们能结合除 H + 以外的其它一价阳离子，例如缬氨 霉素（ Valinomycin ）可结合 K + ，短杆菌肽可结合 K + 、 Na + 和其它一价阳离子穿过线粒体内膜。因此离子载体抑 制剂增大了线粒体内膜对一价阳离子的通透性，从而破坏 了膜两侧的电位梯度，最终导致氧化磷酸化过程被抑制。 四、氧化磷酸化的抑制

五. 电子传递抑制剂 凡是能够阻断电子传递链中某部位电子传递的物 质称为电子传递抑制剂，由于阻断部位物质的氧化 还原状态能被测定，所以利用电子传递抑制剂是研 究电子传递顺序的重要方法，下面列举了若干种常 见的重要的电子传递抑制剂。

1 、鱼藤酮等 阻断从 NADH 向 CoQ 的传 递 鱼藤酮（ rotenone ）、安密妥（ amytal ） 、杀粉蝶菌素（ piericidine ）等。它们的作用 是抑制复合物 I ，阻断电子由 NADH 向 CoQ 的 传递，但不影响 FADH 2 到 CoQ 的氢传递。鱼藤 酮是一种极毒的植物毒素，常用作杀虫剂。 五. 电子传递抑制剂

2 、抗霉素 A 阻断复合物 III 的电子传递 抗霉素 A （ antimycin A ），它是从灰色链球 菌分离出的一种抗生素，抑制复合物Ⅲ的电 子传递，即阻断细胞色素还原酶中电子的传 递，从而抑制了电子从还原型的 CoQ （ QH 2 ）到细胞色素 c 1 的传递。 五. 电子传递抑制剂

3 、氰化物、叠氮化物、 CO 、 H 2 S 阻断复合物 IV 向 O 2 的传递 氰化物（ cyanide, CN － ）、叠氮化物（ azide, N 3 － ）、一氧化碳（ carbon monoxide, CO ）和硫 化氢 ( hydrogen sulphide ) ，这些抑制剂均能阻断 电子在细胞色素氧化酶的传递，即阻断细胞色素 aa 3 至 O 2 的电子传递，其中氰化物（ CN － ）和叠氮化物 （ N 3 － ）能与血红素 a 3 的高铁形式（ ferric form ） 作用而形成复合物, 而一氧化碳（ CO ）则抑制血红素 a 3 的亚铁形式（ ferrous form ）。 五. 电子传递抑制剂

线粒体外的 NADH 通过间接的途径 —— 穿 梭机制进入线粒体。动物细胞内已知有两个 穿梭系统： 磷酸甘油穿梭系统，主要存在于肌细胞； 苹果酸穿梭系统，主要存在于肝细胞。 1. 动物细胞内 六、线粒体穿梭系统 为什么存在穿梭系统于？

磷酸甘油穿梭系统 六、线粒体穿梭系统

磷酸甘油穿梭系统 通过 3- 磷酸甘油与 DHAP 之间的转换，胞液 中的 NADH 间接地转变为内膜上的 FADH 2 ， 经由内膜上的 3- 磷酸甘油脱氢酶 ( 也是以 FAD 为辅基的黄素蛋白 ) 进入 FADH 2 呼吸链。 这种方式不通过复合物Ⅰ, 因此只生成 2 分子 ATP 。 六、线粒体穿梭系统

苹果酸穿梭系统 谷草转氨酶，苹果酸脱氢酶，以及一系列的 透性酶。 通过苹果酸与草酰乙酸之间的转换，间接地 将细胞质中的 NADH 转变为线粒体内的 NADH ，从而进入 NADH 呼吸链。 这种方式要通过复合物Ⅰ。 六、线粒体穿梭系统

苹果酸穿梭系统 六、线粒体穿梭系统