2-D Electrophoresis 二維電泳操作教學 銘傳大學 生物科技學系 學生:賴柏融 製 96年11月

前言 此乃由操作二維電泳同學因需要而製作的教學簡報,僅供參考使用,不足的部分也請自行參照使用手冊或書籍,其中一定有不少遺漏或錯誤,敬請改正指教,此外要有教師指導後使用,避免因錯誤觀念而誤導.

第1章 二維電泳(2-D Electrophoresis)簡介 Core technique of proteomics Capable of simultaneously resolving thousands of proteins in one separation procedure Immobilized pH gradient gels: higher resolution improved interlaboratory reproducibility higher protein loading capacity extended basic pH limit

Sorts proteins according to two independent properties in two discrete steps: the first-dimension step, isoelectric focusing(IEF), separates proteins according to their isoelectric pints(pI); the second-dimension step, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE), separate proteins according to their molecular weights.

Each spot on the resulting two-dimensional array corresponds to a single protein species in the sample Thousands of different proteins can thus be separated, and information such as the protein pI, the apparent molecular weight, and the amount of each protein is obtained

Experimental sequence for 2-D electrophoresis Sample preparation IPG strip rehydration IEF IPG strip equilibration SDS-PAGE Visualization Analysis

圖一 Ettan™ IPGphor™ Isoelectric Focusing System 第2章 IEF儀器 圖一　Ettan™ IPGphor™ Isoelectric Focusing System

Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System Ceramic manifold Electrode assembly Rehydration tray Pre-cut electrode wicks Spirit level IPG Cover Fluid Cleaning solution Cleaning brush

第3章 樣品的製備 The 2-D process begins with sample preparation 第3章　樣品的製備 The 2-D process begins with sample preparation Appropriate sample preparation is absolutely essential for a good 2-D result Keep the sample preparation strategy as simple as possible to avoid protein losses Preserve sample quality by preparing the sample just prior to IEF or storing samples in aliquots at -80°C

第4章 IPG Strip Rehydration (IPG 膠條覆水作用） 先將rehydration tray (覆水槽) 的蓋子打開，首先以ddH2O徹底沖洗覆水槽的凹槽，滴入數滴的Ettan IPGphor Strip Holder Cleaning Solution (清潔液)，用Cleaning brush (清潔刷子)仔細刷洗凹槽，移除任何可能的殘留蛋白質，再用ddH2O沖洗乾淨後，徹底風乾。

依照使用者手冊上的指示，配製適當體積的rehydration solution (覆水試劑) ，依照兩組蛋白質樣本濃度的比例分別和lysis buffer混合而成；接著加入適當體積的IPG Buffer。 利用Spirit level (水平儀) 來測量rehydration tray的放置是水平的。 將配好的rehydration solution分別注入要放置IPG膠條的凹槽。

小心的將膠條上的保護塑膠條撕開，膠面朝下，輕輕的把膠條放入含有rehydration solution的凹槽，小心移動膠條，讓整條膠條都有覆蓋住液體。小心不要造成小氣泡的產生。 在凹槽中滴入IPG Cover Fluid (膠條覆蓋油) 直到膠條全部被覆蓋。 蓋上蓋子後至少靜置十個小時，最佳的操作是讓膠條隔夜覆水。

隔夜覆水後，取出膠條，滴去多餘的cover fluid，因為rehydration solution包含了蛋白質樣本，因此膠條在覆水完畢後，不需另外裝載蛋白質樣本。

第5章 First-dimension Isoelectric Focusing (IEF) 隔夜覆水後，取出膠條，滴去多餘的cover fluid，因為rehydration solution包含了蛋白質樣本，因此膠條在覆水完畢後，不需另外裝載蛋白質樣本。 將manifold放置Ettan IPGphor IEF unit的平臺，用spirit level確定是水平擺放。 將IPG cover fluid 滴入並均勻覆蓋manifold的12個凹溝，即使凹溝的使用數目未滿12個。

膠面朝上，將膠條放進IPG cover fluid底下，此時要確定膠條的正負極端和manifold的正負極端是相符合的。 在paper wick (紙蕊) 滴上150μl的ddH2O使其濕潤，在每一條IPG膠條的兩端各放上一片，而paper wick的一端必須要和膠條的尾端互相重疊。

把electrode assembly (電級配組) 的electrode cams (電極凸輪) 打開，把electrode assembly放置在所有paper wick上面後，旋轉electrode cams使其關閉。檢查paper wick是否和膠條的尾端重疊，而electrode是放在paper wick之上。 蓋上Ettan IPGphor儀器的蓋子，開始進行一維等電點電泳。 電泳結束後，取出膠條，放入原先的覆水槽，冰進-80°C冰箱冷藏。

第6章 Second-dimension SDS-PAGE 用電泳鑄膠組製做進行2D SDS-PAGE的膠片備用，但使用的製膠玻璃模板有所不同，做出來的膠片也比SDS-PAGE的膠片厚一倍。 配製SDS equilibration buffer及Agarose Sealing Solution。 在進行1st equilibration之前，取70 mg的DTT加入到7 ml的SDS equilibration buffer。

把膠條取出後，放進另一覆水槽的凹槽內，加入約3 ml含有DTT的equilibration buffer，蓋上蓋子，靜置15分鐘進行平衡作用。 在進行2nd equilibration之前，取150 mg的iodoacetamide (IAA)加入到6 ml的SDS equilibration buffer。 把膠條移到旁邊的凹槽，加入含有IAA的equilibration buffer (不含DTT)，靜置15分鐘進行二次平衡作用。

煮溶預先配好且已凝固的Agarose Sealing Solution。 用蛋白質轉漬系統組裝好電泳配備，膠條先用ddH2O沖洗後，仔細的放到running gel的上方。膠條旁邊則放上一塊剪裁成一個覆水槽凹槽寬度，且中心已先滴上2 μl marker的率紙。 加入溶解的Agarose Sealing Solution到running gel上方，覆蓋住膠條和marker濾紙，在凝固之前，用小夾子稍微壓一下膠片，確保膠條和running gel之間沒有空隙或是氣泡。

120 V進行2D 電泳。 電泳結束後，用Coomassie stain染膠片30分鐘，再用destain buffer退染30分鐘。 用電泳顯影系統照下電泳圖之後，再進行封膠。

第7章 Visualization and Evaluation of Results 觀察比對控制組和對照組的蛋白質二維電泳圖，試著找出兩者之間不同的蛋白質轉漬點，再和其他重覆實驗得到的電泳圖做比對，確定觀察到的不同之處皆有出現在別的電泳圖。 挖取不同處的蛋白質，做In-Gel Digestion處理，進行MALDI-TOF mass spectrometry，對蛋白質樣本做基因的鑑定。