Received 15 June 2005; revised 12 September 2005; accepted 7 October 2005 Effects of dissociated glucocorticoids on OPG and RANKL in osteoblastic cells E.L. Humphrey a, J.H.H. Williams a,b, M.W.J. Davie a, M.J. Marshall a, 姓名 : 萬映汝 系級 : 生物科技學系四年級 學號 :

Abbreviation GIOP- GIOP- glucocorticoid-induced osteoporosis GR- glucocorticoid receptor hFOB- human fetal osteoblast nGRE- negative glucocorticoid response element OPG- osteoprotegerin 促骨生成蛋白受體為蝕骨 細胞分化抑制因子 RANKL- receptor activator of nuclear factor kappa B ligand 促骨生成蛋白結合子為促進蝕骨 細胞生成的主因子

Introduction Glucocorticoid treatment often leads to unwanted side effects including weight gain, skin thinning, osteopenia, eye defects, depression, diabetes, adrenal insufficiency and peptic ulcers ， 但長期使 用 Glucocorticoid 治療會導致 GIOP. Adult bone remodeling is carried out by osteoblasts and osteoclasts, which are controlled by various hormones, cytokines and growth factors.

骨骼新陳代謝動態之平衡 造骨速率與蝕骨速率相當 骨骼新陳代謝動態之平衡 造骨速率與蝕骨速率相當

骨骼新陳代謝正常狀況

hormonal 和 cytokine 會調控造骨細胞產生 RANKL 的 可溶性 cytokine ，會跟蝕骨細胞上的 RANK receptor 鍵結或是跟它的 precursor, 刺激骨骼的再吸收 造骨細胞會產生 OPG, 跟 RANKL binding 阻止與 RANK receptor 鍵結來抑制蝕骨細胞的生成 GR 與 nGRE 結合會抑制基因轉錄及物理性阻斷轉 錄機制運行，或阻斷一正向調控的轉錄因子去跟 它的 response element 結合使基因轉錄被抑制  cis- repression

Actived GR 可抑制一持續性的活化，或抑制具誘 導性的轉錄因子，利用 protein-protein 的交互作用 不需與 DNA binding 來防止 activating 基因轉錄  trans-repression Ligand 與 GR 鍵結造成 receptor 構型改變 transrepress 基因轉錄，但有較少甚至無 transactivation 活性  dissociated glucocorticoid (symmetrical glucocorticoid 則會造成 GR 的 transactivation 及 transrepression) 結果顯示 dissociated glucocorticoid 及 deflazacort 較 symmetrical glucocorticoid prednisolone 對 RANKL 的 活化作用低，且在某些情況下較無法抑制 OPG 製 造

實驗方法細胞培養 MG63cell(European collection of cell cultures) 培養在 α-minimal essential media (αMEM) at 37°C +10% 胎牛血清 IU/ml 苯甲基青黴素 μg/ml 鏈黴素 +2 mM L-glutamine 在含有 5 %carbon dioxide 潮濕的環境下培養

人類胚胎造骨細胞 hFOB cells 培養在 DMEM/HAMs F12 medium +10% 胎牛血清 IU/ml 苯甲基青黴素 μg/ml 鏈黴素 +2 mM L-glutamine +0.3mg +0.3mg/ml geneticin 在潮濕環境 33.5°C 下培養 7 天 - 細胞增生 39.5°C2 天 - 細胞分化

Both cell types were seeded in 96-well plates at 2.8 × 10−3 cells/cm2for OPG protein determination 24-well plates for total RNA extraction after 48h and stored at −20°C for OPG measurements 加入 Tetrazolium (MTS 190 μg/ml) 及 phenazine ethosulphate (PES 30 μM) 溶液到毎個 well 作用 30min

OPG ELISA 用 用 goat anti-human OPG capture antibody Captured OPG was detected with biotinylated anti-OPG antibody 用 10% sulphuric acid 停止反應 用 Dynatech Microtitre plate reader 用 Sigma plot software

RNA extraction and first strand cDNA synthesis Qiagen RNeasy kit Real-time PCR 利用 利用 the ABI Assays on Demand primers and Taqman universal PCR master mix

在 MG63 cell 中 dexamethasone 抑制效果最佳

在 hFOB cell 中 dexamethasone 抑制效果最佳

The potency of each GR ligand is described by its IC50, and its effectiveness is described by the maximum inhibition. 10 倍 6倍6倍6倍6倍 12 倍 達最大抑制 OPG 產量 一半所需的化合物濃度

在 MG63cell 中加入 10μM 的 anti-glucocorticoid RU486 OPG 濃度皆提高

control 為 anti-glucocorticoid control RU43044 ( in MG63 cell )

control 為 anti-glucocorticoid control RU43044 (in hFOB cell )

control 為 inactive racemer AL438-F2 ( in MG63 cell )

control 為 inactive racemer AL438-F2 ( in hFOB cell )

三個 RU compond 的 抑制能力及最大抑 制效果相近，但較 prednisolone 低 AL438-F1 及 ZK 抑制效能 力低近 50 %

Effect of Glucocorticoids on OPG and RANKL expression

hFOB cell 內 OPG 與 RANKL 訊息的相對調控 造成的 message 比例 Prednisolone 因為對 OPG 抑制效果佳 Prednisolone 因為對 OPG 抑制效果佳所以相對比值就較高

Discussion Glucocorticoid 會刺激蝕骨細胞分化，藉由直接增強 RANKL 訊號，間接抑制 INF-β 的產生，並刺激造骨細胞 產生 RANKL 抑制產生 OPG ，以利蝕骨細胞的生成及骨 骼的再吸收能力上升 Deflazacort 相較於 prednisolone 對造骨細胞 OPG 抑制能力 低 10 倍，但在高濃度下兩者效果相當，且 Deflazacort 對 RANKL 的刺激能力低於 prednisolone ( 都是由類固醇的 GR ligand ； deflazacort 被視為 ” bone sparing ” Glucocorticoid) dissociated glucocorticoid 屬非類固醇的 GR ligand ，仍具有 抗炎的活性但呈現較少的 transactivation 的活性

dissociated glucocorticoid AL438 對 MG63cell 的 OPG 產 生及骨鈣蛋白質 ( 視為是骨骼形成及造骨功能的 marker ， prednisolone 會抑制它的產生 ) 產生的抑制較 prednisolone 弱 所有活化的 dissociated glucocorticoid 對造骨細胞 OPG 產生的抑制能力都較 prednisolone 低；所有的高濃度 的 RU compounds 對 OPG 的抑制效果和 prednisolone 相 當 AL438-F1 和 ZK21648 在 hFOB 、 MG63 cell 中對 OPG 抑 制效果明顯低於 prednisolone 近來發現 GR 會藉由招集不同 co-regulator 對基因產生 不同的影響，因為 GR 的 ligand binding domain 有一個 高度保留且含有 glutamate 及 lysine residues 的序列  charge clamp

charge clamp 可與 GR 的 co-regulator 鍵結，當被 GR ligand binding 改變結構使基因轉錄被抑制 AL438 不與 co-activator PGC-1 反應，但 prednisolone 會 (PGC-1 牽涉到 glucocorticoid 對肝臟 glucose 產量的 調控 ) ，因此相較於 prednisolone 可導致較少的血糖 過高問題 利用 GR ligand 這種 co-regulator 去改變 GR 的結構使 不會刺激 RANKL 的表現及抑制 OPG 的產生，因 此不會刺激骨骼的再吸收，降低骨質疏鬆的風險 利用 GR ligand 這種 co-regulator 去改變 GR 的結構使 不會刺激 RANKL 的表現及抑制 OPG 的產生，因 此不會刺激骨骼的再吸收，降低骨質疏鬆的風險