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Isolation and characterization of organism producing thermostable lipase 報告學生 : 莫曉嬌宋志潔報告日期 :2003/12/29

前言  Lipase ( 脂肪分解酵素 ) 可用作分解脂肪  環境中有許多微生物可產生 lipases ，催化 triglycerol 分解成 glycerol 與 fatty acid  微生物所產生的 lipase 多為胞外酵素  Lipase 多為適中溫酵素

 Lipase 有許多用途： 1. 食品工業：起士 2. 清潔劑工業 3. 油脂工業：甘油 4. 廢水處裡 5. 醫療：吸收不良病患  Thermostable lipase ： 1. 嗜高溫微生物 2. 一般溫度生長之微生物

目的從環境中採集樣本，希望能找出並分離﹑ 鑑定能產生 thermostable lipase 的微生物。

實驗架構 Tributyrin agar plate ：分離不同受質培養基 +Rhodamin B 堆肥：篩菌生化測試：鑑定

材料  培養基 1.Tributyrin agar plate (per L) ： Peptone 5.0g Beef extract 3.0g Agar 25.0g Tributyrin 15.0g 2. 不同受質培養基： Peptone 5.0g Beef extract 3.0g Agar 25.0g Olive oil ﹑ Corn oil ﹑ Pig oil ﹑ Tween g/L Rhodamin B 10.0ml/L

3. 生化測試培養基： NA+NaCl ﹑ Nitrate broth ﹑ SIM ﹑ MR-VP broth ﹑ Phenol red+sugar broth ﹑ MSA ﹑ Citrate ﹑ Urea broth  樣本：木柵動物園之堆肥  0.85% NaCl 無菌生理實驗水

實驗流程  培養和分離 1g 樣本 +9mL 0.85% NaCl ↓ 取 0.1ml 之 10 1 ﹑ 10 2 ﹑ 10 3 ﹑ 10 4 ﹑ 10 5 稀釋度塗抹平板，在 Tributyrin agar plate ↓ 50 ℃培養 1-3 天 ↓ 觀察有無生長與透明環產生 ↓

選擇有透明環之菌落，在 Tributyrin agar plate 上作純培養， 50 ℃培養 1-3 天 ↓ 在 Tributyrin agar plate 上作繼代培養， 50 ℃與 60 ℃培養 1-3 天 ↓ 培養於 Tributyrin plate ﹑ Olive oil plate ﹑ Corn oil plate ﹑ Tween20 plate ﹑ Pig oil plate ， 50 ℃與 55 ℃培養 1-3 天 ↓ 觀察有無生長與透明環產生 ↓

培養於 Tributyrin plate ﹑含有 Rhodamin B 的 Olive oil plate ﹑ Corn oil plate ﹑ Tween20 plate ﹑ Pig oil plate ， 50 ℃與 55 ℃培養 1-3 天 ↓ 觀察有無生長與透明環及螢光產生 ↓ 鑑定

 鑑定 Gram stain ： G(+) rods ( 圖二 ) ( 圖二 ) Spore stain ( 圖四, 圖五 ) 圖四圖五 Glucose fermentation 1B, 1C,1D, 1E, 1F, 2A (Bacillus sp.) Catalase Sporosacina sp. Clostridium sp. Desulfotomaculum sp. + - Motile +- Lactobacillus sp. Erysipelothrix sp. 2D (Brochothrix) Listeria sp. Kurthia sp.

1B, 1C,1D, 1E, 1F, 2A(Bacillus sp.) 60 ℃生長 +- 1C, 1E (B. stearothermophilus) 10%NaCl 生長 +- 1D (B. pantothenticus) 1B, 1F, 2A (B. megaterium)

 鑑定 ( 續 ) Gram stain: G(+) cocci Catalase +- Oxidase Streptococcus sp. +- Micrococcus sp. Motile +- 2E (Planococcus sp.) Staphylococcus sp. Stomatococcus sp.

結果

討論  鑑定的結果之正確性，原因是 : 1. 有很多生化測試是 d 或 ND 2. 所作的生化測試並不完全 3. 測得的結果很類似 4. 部分菌株特性 Bergey’s manual 中没列  改善上述缺點的方法 : 1. 操作技術純熟 2. 用 Biolog 分析

 生化測試之糖類發酵 : 糖類改為過濾滅菌應可改善結果之判讀  培養條件 : 1. 培養基受質選擇 : (1) 受質結構的不同 (2) 受質濃度用量 2. 培養溫度之選擇

參考文獻 Rohit Sharma, and Yusuf Chisti Production, purification, characterization, and applications of lipase. Biotechnol Advances.19: Yougxiang Wang Thermostable alkaline lipase from a newly isolated thermophilic Bacillus Strain A30-1 (ATCC 53841). J Fermen Bioeng. 79: 謝汎擎耐熱脂肪分解酵素分離與特性測定. Bergey’s manual. Vol. 2.

圖一､木柵動物園堆肥樣本

圖二､革蘭氏陽性桿菌 (1B)

圖三､革蘭氏陽性球菌 (2E)

圖四､孢子染色結果 (1D)

圖五､孢子染色結果 (1F)

圖六. 2D 菌在 Tributyrin plate 產生的透明環

圖七､ 2E 菌在 olive oil plate 上產生的透明環

圖八､ 2E 菌在 Pig oil plate 上產生螢光