单分子探测技术 报 告 人： 韩 洁 报 告 人： 韩 洁

单分子探测技术产生的原因 单分子探测的主要基本技术 单分子荧光检测的物理基础 单分子荧光检测技术应用 主要内容

单分子探测技术的产生原因 通常对大量分子集合体的观察测量只给出一个 参数的整体平均值, 单分子水平的测量则完全排 除了这种平均效应； 单分子体系的变化过程与时间密切相关 。采用 分子集合体时不能观察到这种时间相关的行为； 观察到未知领域中的新效应。

单分子检测的基本技术 （ single molecules detection, SMD ) 扫描探针显微技术 (SPM) 光镊技术 荧光技术

单分子荧光检测的物理基础 荧光寿命 τ= 1/(K f +ΣK ) 荧光量子产率 φ = 发射的光子数 / 吸收的光子数 光漂白几率

光漂白 荧光分子在激发光的照射下, 经历多次受 激、退激过程后, 往往造成分子内部结构 发生不可逆的变化, 不能吸收更多的光子 而进一步发射荧光。 光漂白几率 φ d = 1 / 分子在漂白前吸收的平均光子数

提供了一种 “ 远距离操作 ” 的方法. 在不丧 失优越的空间分辨率的情况下对样品扰 动很小。 荧光技术特点

单分子荧光特性 量子跳跃特性 取决于单分子的周围环境和猝灭途径 荧光偏振特性 单分子荧光分子具有唯一的固定吸收和发射偶 极矩，因此在偏振激光的激发下，通过测量单 个分子的吸收和荧光的偏振方向，可以完全确 定单个荧光分子的空间取向。

单个 GFP 分子的荧光 on-off 现 象 Off 态主要来源于单个 GFP 分子的光化学诱导的长寿命的暗态

单分子荧光探测的必须条件  在被照射的体积中只有一个分子 与激光发生相互作用  确保单分子的信号大于背景干扰信号 ( 有效减少拉曼散射、瑞利散射及其杂质 荧光所造成的干扰 )

难点：杂散光背景比荧光信号大得多 Rayleigh 散射光 光学器件的散射光 溶液杂质的荧光 溶液的 Raman 散射光 光谱过滤 减小灵敏体积 时间门技术 杂散光减小方法

LIF 的基本原理 在激光的照射下, 分子吸收光子而被激发到某一 激发态, 在退激的过程中发射荧光。对于荧光量 子产率较大的分子, 其激发态的寿命为 ns 量级, 而分子通过激光束的时间为 ms 量级, 因此在连 续或准连续激光的激发下, 一个分子在通过激光 束的过程中, 将被多次反复激发而发射出大量的 荧光光子，即所谓的 “ 光子爆发 ” （ photon burst)

单个染料分子所能发出的荧光 光子数目 两个假定： 激光光束正好聚焦在探测灵敏区的中间 染料分子通过探测灵敏区的中心 P: 激光束的平均功率 ω: 聚焦半径 λ: 激光波长 σ: 光吸收截面 v: 样品的流速 h: 普朗克常数 N A =E A λ/hc =0.76σPλ/ωvhc

激光功率对荧光强度的影响曲线

共聚焦显微镜原理

昆虫脑部双重染色 a. 传统的荧光显微影像 b. 共聚焦显微镜影像

单分子对荧光能量共振转移 (sp F R E T ) 原理： 标记两个不同的荧光基团, 一个是供体Ｄ。另一个 受体Ａ 。受体的吸收光谱与供体的发射光谱相重 叠 。由于偶极 - 偶极相互作用, 能量从供体传递到 受体。 通过探测能量转移效率, 可确定两点间的距 离, 并且通过检测能量转移效率随时间的变化来推 测构象的变化所引起的两点间距离的变化。

单对Ｄ - Ａ体系标记的单个无抑制 剂蛋白的能量转移过程

展望 作为一门新兴边缘学科, 单分子科学展现出蓬勃 的生机。 1. 单分子实验方法还有待于进一步开拓与改进。 如荧光技术中时间匹配 ( 荧光漂白 ) 。 2. 单分子理论还有大量工作可做。单分子实验方 法的一个共同特点是信息量大, 而有效地把这些信 息从实验数据中提取出来就需要强有力的理论指 导。 3. 随着单分子科学的发展, 越来越多的新的物理 效应与各种应用将被揭示出来。