Real time PCR 扬州大学 生物科学与技术学院

原理 聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。 在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行 定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行 定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但 是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始 模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一 特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术 应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中 每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性 的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质， 随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等 比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可 以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线 图 ( 如图 ) 。

原理 荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号 阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号 阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法 判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数 级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性 关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的 对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在 这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时 荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光 阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的 一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上， 但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光 信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达 设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。

原理 CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多， CT 值越小。利用已知起始拷 贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表 起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图 所 示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从 标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

Real-Time PCR 使用的染料 Dye Excitation maximum (nm) Emission maximum (nm) Fluorescein FAM SYBR Green I JOE VIC Cy® TAMRA ROX Texas Red Cy

Real-Time PCR 成功的关键因素 Primer （引物） No template control (NTC) （非模板对照） cDNA template （ cDNA 模板） Endogenous reference gene （内参基因） Reaction volume （反应体积）

引物设计原则 保持 %GC 在 : 20–80% 引物的 T M : 58–60 °C 在 3’ 末端的 5 个核苷酸中，只有 1 或 2 G + Cs 引物长度 : 9 – 30 mer 引物浓度 : 5 μM 设计无重复序列的引物 ( 扩增产物的大小 : 50~150 bps)

如何优化引物浓度

不同引物浓度的扩增图

解离曲线

Same detector at different stage

Real-Time PCR 成功的关键因素 Primer （引物） No template control (NTC) （非模板对照） cDNA template （ cDNA 模板） Endogenous reference gene （内参基因） Reaction volume （反应体积）

如何避免污染 用 1.5ml Microtube 分装小体积样品 所有样品使用前必须离心 使用八连排反应管 用 70% 酒精擦拭所有器具及实验桌 计划好实验样品表格（三个重复） 耐心安静慢慢操作实验 随时保持双手干净 不可重复使用 tip 不可使用八头 pipetman 不可在八连排反应管上贴标签或写字

Real-Time PCR 成功的关键因素 Primer （引物） No template control (NTC) （非模板对照） cDNA template （ cDNA 模板） Endogenous reference gene （内参基因） Reaction volume （反应体积）

第一步 cDNA 模板的定量 250 μg total RNA 0.2 μg poly A + RNA (DNase I) 1st cDNA (RNase H) 20 ng / μl 10 μg total RNA (DNase I) 1st cDNA (RNase H) 20 ng / μl

Real-Time PCR 成功的关键因素 Primer （引物） No template control (NTC) （非模板对照） cDNA template （ cDNA 模板） Endogenous reference gene （内参基因） Reaction volume （反应体积）

内参基因 拟南芥 : actin & ubiquitin 烟草 : actin & ubiquitin 水稻 : actin & ubiquitin

Actin Amplification Plot

Actin 系列稀释

靶基因系列稀释

相同 PCR 效率

Real-Time PCR 成功的关键因素 Primer （引物） No template control (NTC) （非模板对照） cDNA template （ cDNA 模板） Endogenous reference gene （内参基因） Reaction volume （反应体积）

Real-Time PCR reaction F Primer( 5 μ M ) 200 nM 2 μl R Primer( 5 μ M ) 200 nM 2 μl cDNA ( 20 ng / μl ) 100 ng 5 μl Water 16 μl 2x SYBR Master Mix 1x 25 μl 50 μl Final conc.

Real-Time PCR 条件 50 ℃, 2min 95 ℃, 10 min 95 ℃, 15 sec 40 cycles 60 ℃, 1min 60 ℃, melting curve analysis

相对定量 设定相对定量的对照 : △ △ Ct 分析 DNA 或 RNA 含有靶基因的数量可以通过相应的 标准曲线来定量 – 使添加的样品量标准化 – 需靶基因的内部对照

tissue Lane treatment (day) tissue2 tissue Lane treatment (day) tissue2

tissue Lane treatment (day) tissue2

tissue Lane treatment (day) tissue2

Lane treatment (day) tissue1 tissue2

tissue Lane treatment (day) tissue2

Q-PCR primer for RT-PCR Q-PCR product RT-PCR tissue Lane treatment (day) tissue2

谢谢