د. عمر عبد القادر

الصبغ والفحص للمجهر الإلكتروني مقدمة : الصبغة السالبة طريقة التظليل طريقة القوالب صبغ القطاعات الرقيقة جدا الصبغة المزدوجة صبغ القطاعات السميكة د. عمر عبد القادر

المقدمة يعني الصبغ بالنسبة للمشتغلين في مجال المجهر الإلكتروني زيادة التباين (Contrast) للشيء المفحوص بوضع ذرات عنصر ذو عدد ذري أعلى من تلك الداخلة في تركيب النسيج أو العينة المفحوصة مثل الكربون والأكسجين والنيتروجين والهيدروجين وغيرها.والتي غالبا ما تكون مواد عضوية . فالتثبيت برابع أكسيد الأوزميوم سوف تضيف مبدئيا بعض ذرات عالية العدد الذري (=76)على الأجزاء التي تتفاعل معها من العينة المثبته مثل أغشية الدهون الفوسفاتية ،و الدهون غير المشبعة وبعض مجاميع البروتينات . كذلك البرمنجنات تصبغ أغشية الدهون الفوسفاتية ولكن مثبتات الألدهيدات لا تزيد في عمليات التباين. وعمليات الصبغ للمجهر الإلكتروني لا تختلف في مضمونها عن المجهر الضوئي لكن الصبغ في المجهر الضوئي عبارة عن تفاعل بين مواد ذات ألوان (صبغات ) مع مكونات النسيج فيأخذ الوان تختلف في درجة امتصاصها للضوء بينما الصبغ في المجهر الإلكتروني تعني قدرة هذه المواد الكيميائية ذات الأوزان الذرية العالية مع مكونات الخلية المختلفة على تشتيت الإلكترونات (شكل 11-1أ-ب). يمكن إجراء الصبغ للعينات إما قبل طمر العينة أو بعد عمليات التقطيع.

د. عمر عبد القادر

الصبغات المستخدمة وطرق الصبغ المتبعة في المجهر الإلكتروني هناك صبغتان يمكن استعمالهما قبل أو بعد عمليات الطمر هما: 1- حمض التنجستيك الفسفوري (Phosphotungstic acid PTA) 2- وخلات اليورانيل (Uranyl acetate) وكلاهما تذوبان في مذيبات قابلة للجفاف.أو يمكن استخدام محلولهما المائي في صبغ القطاعات. وتختلف الصبغتان عن بعضهما البعض بأن الأولى ذات شحنة موجبة (كاتيون(Cationic) لذا ترتبط بالبروتينات وتعتبر صبغة جيدة للحويصلات الإفرازية واللييفات العضلية والكولاجين . أما صبغة خلات اليورانيل فهي ذات شحنة سالبة (انيونكAnionic ) وهي صالحة لصبغ الحموض النووية وكذلك البروتينات إلى حد ما. ومن أهم الطرق المستخدمة في عمليات الصبغ للمجاهر الإلكترونية: 1- الصبغة السالبة Negative staining 2-طريقة التظليلShadowing method 3- طريقة القوالب Replica method 4- صبغ القطاعات الرقيقة جدا 5-صبغ القطاعات السميكة د. عمر عبد القادر

1- الصبغة السالبة Negative staninig -تعتبر الصبغة السالبة من ابسط طرق الصبغ المستعملة في المجهر الإلكتروني فهي تلعب دورا بارزا في توضيح التراكيب الدقيقة لبعض من عمليات البيولوجية وخاصة الفيروسات وسطوح البكتيريا وكذلك بعض العضيات السيتوبلازمية . -تتم عملية الصبغ بإضافة محلول مخفف من أحد أملاح المعادن الثقيلة إلى العينة -ثم توضع قطرة صغيرة من هذا المحلول الذي يحتوى العينة فوق شبكة نحاسية مغطاة بفلم دعامي رقيق من الكربون أو السلودين ). بعدها يزال الزائد من محلول الصبغة بإستخدام حافة ورقة ترشيح ، ثم يترك الفيلم الرقيق المتكون على سطح الشبكة النحاسية ليجف تماما. بذلك تصبح جزيئات المادة المراد دراستها قد انطمرت بالصبغة . الصبغة السالبة تصبغ الأرضية (Back grund) التي توجد عليها العينية (شكل 11-2) د. عمر عبد القادر

24- طريقة الصبغ بالتظليل Shadowing method -تعتبر هذه الطريقة من أقدم الطرق المستخدمة في صبغ عينات المجهر الإلكتروني -وتستخدم في تقدير حجم الجزيئات مثل الفيروسات والبكتيريا وغيرها. -كما تعتبر جزءا حيويا في عمليات القوالب وتعطي قوة تباين أكبر وتكمن من فحص الطول أو البعد الثالث للجزيئات (شكل 11-3). د. عمر عبد القادر

3-طريقة القوالب Replica Method - من أقدم الطرق المستخدمة في المجهر الألكتروني . في البداية كانت تستخدم الطريقة للعينات غير الحية ثم تم استعمالها أيضا في مجال الكائنات الحية وخاصة دراسة سطح الخلايا وعلاقة الطفيل بالعائل . -طريقة القوالب هي عبارة عن عمل فيلم رقيق من المادة مشابه لطبوغرافية سطح العينية -من أهم صعوبات هذه الطريقة هو فصل القالب (Replica)عن سطح العينية وهذا يحتاج إلى تحطيم العينة عن طريق تذويبها من قالب الكربون مع انه أحيانا يمكن فصلها عن طريق الطفو(Floatation) وهناك طريقتان لعمل القوالب : 1- قوالب أحادية الطور Single- stage replica 2- قوالب ثنائية الطور two-stage replica 1-وتتلخص طريقة أحادية الطور بتبخير ذرات الكربون على سطح ميكا نظيفة ، ثم غمر صفيحة الميكا في ماء مقطر نضيف لكي يطفو الكربون على سطح الماء إن هذا الفيلم الكربوني سوف يلتصق بالعينة . 2-أما طريقة القوالب ثنائية الطور فهي تمثل في عملية فليم بلاستيكي سميك فوق سطح العينة المراد فحصها ، ومن ثم يمكن سحب هذا الفيلم بسهولة ، بعد سحب الفيلم سوف تنطبع علية صفات سطح العينية ، ثم يغطى هذا الفيلم بطبقة من الكربون المتبخر. عند ها يذاب البلاستيك تاركا خلفه الطبقة الكربونية وكذلك سطح العينة كاملا كما في الشكل 11-4) د. عمر عبد القادر

د. عمر عبد القادر

4- صبغ القطاعات الرقيقة جدا. من أكثر الطرق شيوعا واستعمالا في المجهر الإلكتروني ومن أكثرها مناسبة لفحص عينات الأحياء لمعرفة وملاحظة تراكيب الخلية الأصباغ المستعملة لصبغ القطاعات الرقيقة: 1- صبغات الرصاص (Lead stains) تعطي صبغة الرصاص قوة تباين عالية وتصبغ معظم مكونات الخلية وتستعمل إما بمفردها أو بعد الصبغ القطاعات بالخلات اليوارانيل كصبغة روتينية للقطاعات الرقيقة . إن صبغات الرصاص تتفاعل مع بقايا ثاني اكسيد الكربون مكونة كربونات الرصاص غير الذائبة ،لذا يجب اخذ الإحتياط ومنع ذلك بواسطة استخدام ماء مقطر مغلي لمدة 10 د. لمحلول الصبغة ،وكذلك حفظ الصبغة في انابيب مغطاة بإحكام ، ويمكن ترشيح الصبغة بمرشحات ثقوبها(0.025ميك وطريقة صبغ الشبكات النحاسية إما فرادى وذلك بطفوها على نقطة من محلول الصبغة في حوض بتري مغطى ،لمدة زمنية معينة (10-30 د) أو بتحميل عدد من الشبكات على حلقات مطاطية صغيرة وصبغا ها جميعا بعدها تغسل الشبكات بالماء المقطر خالي من ثاني اكسيد الكربون وتعتبر مركبات الرصاص من المواد السامة ولابد من التخلص منها بعناية . وهناك عدة طرق استخدمت فيها صبغات الرصاص مثل 1- طريقة كازنفسكي ب- طريقة ميلوننج جـ- طريقة رينولد (انظر المرفق) د. عمر عبد القادر

- تابع صبغ القطاعات الرقيقة جدا. 2- صبغات خلات اليورانيل (Uranyl acetate stains (CH3COO)3 UO2 2H2O -تستخدم بشكل كبير إما منفردة أو تصبغ قبل صبغات الرصاص - ذات شحنة سالبة (Anionic )وصالحة لصبغ الحموض النووية والبروتينات - لابد من الحذر عند التعامل مع الصبغة لأنها ذات خاصية إشعاعية وسمية محلول خلات اليورانيل يتأثر بالضوء لذا يحفظ في مكان مظلم اثناء التخزين أو الصبغ. يستعمل عدد من محاليل هذه الصبغة بإستخدام مذيبات مختلفة منها: أ- محلول خلات اليورانيل الكحولي :ِAlcoholic uranyl acetate solution يستخدم لصبغ القطاعات الرقيقة بشكل كبير ، وذو نفاذية عالية ،مع الكحول الأيثيلي ،لكن كحول الميثانول قد يذيب الفيلم الدعامي للشبكات. ب- محلول خلات يوارنيل المائي :Aquous solution of uranyl acetate تعطي الصبغ قوة تبين عالية تحتاج الى وقت اطول 30 د. ج- محلول خلات اليوانيل المغنيسية (Magnesium uranyl acetate) أكثر ذوبانا في الماء تحتاج إلى وقت أطول 3 ساعات عند درجة 40مْ أكثر ثباتا وأقل حموضية ويحفظ في الظلام لعدة شهور عند درجة حرارة الغرفة. د. عمر عبد القادر

ج- طريقة صبغ العينات (المكعبات ) بخلات اليورانيل لقد وجد بعض الباحثين انه من الأفضل صبغ القوالب العينة بخلات اليورانيل بعد عملية التثبيت . تعمل الصبغة على تثبيت الدهون الفسفورية والبروتينات وتجعلها اقل تأثرا بالكحولات خلال عملية التجفيف. وقد وصف العالم كارنوفسكي 1967 طريقة الصبغ كالتالي: 1-تغسل العينات عدة مرات بعد عملية التثبيت في محلول منظم (0.05 جزيء) من ماليات الصوديوم الهيدروجينية مع هيدروكسيد الصوديوم عند اس هيدروجيني 5.2 لمدة 30 د 2-يتم صبغ العينة في محلول خلات اليورانيل (0.5- 2%) المذاب في محلول الغسيل المنظم لمدة ساعة عند 4مْ وفي الظلام . 3- تمرر العينات بسرعة في الكولات او الأستون لنزع الماء ثم تطمر العينات في احد مواد الطمر الراتنجية . د. عمر عبد القادر

3- الصبغة الثنائية المزدوجة Double staining تتم الصبغة الثنائية عادة بصبغ القطاعات أولا بخلات اليورانيل ثم الصبغ بأملاح الرصاص. تعطي هذه الطريقة قوة تباين اكثر من غيرها تعتمد مدة الصبغ على سمك القطاعات ونوع الراتنج المستخدم ونوع النسيج المصبوغ ودرجة الحرارة . صبغ العينات بخلات اليورانيل الكحولية لمدة 15 د. ثم تصبغ العينات بسترات الرصاص (5-10د ) عند درجة 25مْ وذلك بوضع قطرات صغيرة على لوح بلاستيكي صغير يمكن تغطيته عن الضوء ثم توضع الشبكات على سطح القطرة وعليها القطاعات كل شبكة في قطرة ثم تغسل بعد الصبغة الأولى بغمسها بقرة الكحول ثم الماء المقطر ثم تجفف بواسطة طرف ورقة ترشيح ثم توضع العينات على سطح قطرة الصبغة الثانية (سترات الرصاص) لمدة 10 د. ثم تغسل الشبكات في تيار ماء خفيف ثم تجفف الشبكات بحيث توضع على ورقة ترشيح والقطاعات للأعلى. د. عمر عبد القادر

4- أصباغ أخري Other Cytological stains يعتبر معدني اليورانيوم والرصاص أكثر المعادن الثقيلة استعمالا في صبغ القطاعات الرقيقة . هذا وتوجد عدد من العناصر التي تعتبر جيده وتعطي قوة تباين كافية عند استخدامها أحيانا في محاليل الأصباغ من هذه العناصر : الأوزميوم والتنجستن والمغنيسيوم والكروم والفاندوم والمولبيدينم. أ- رابع أكسيد الأوزميوم: تصطبغ الأنسجة عند تثبيتها في رابع أكسيد الأوزميوم وقوة التباين كافية في حالة الطمر في مادة الميثا اكريلات ،لكنها غير كافية في الأبوكسي. ب- حمض التنجستك الفوسفوري: صبغ الأنسجة في محاليل مخففة ولمدة قصيرة سوف تعطي نتائج أفضل من المحلول المركز الذي يحطم محتويات الخلية ونظرا لذلك قل استخدام حمض التنجستن في صبغ العينات . جـ الصبغ ببرمنجنات البوتاسيوم: استخدمها العالم لفت 1956 كمثبت وصبغة في نفس الوقت في3% محلول برمنجنات معدل بمنظم الفيرنول لمدة2 ساعة عند اس 7.4 ،تعطي تثبيتا جيدا وتصبغ الأجسام الغشائية واللسيوسومات لكن بقية المكونات الخلية تكون باهته.كما انها تحطم الخلايا الحيوانية ، لكنها أحيانا تستخدم للأنسجة النباتية . 4- أصباغ أخري Other Cytological stains د. عمر عبد القادر

صبغ القطاعات البلاستيكية السميكة من الضروري عمل بعض القطاعات السميكة للعينات المعدة للمجهر الإلكتروني لكي تفحص بالمجهر الضوئي مما تسهل عملية المتابعة والفحص بالمجهر الالكتروني .(شكل 11-5) هناك عدة طرق لصبغ مثل هذه القطاعات البلاستيكية السميكة : 1- تنقل القطاعات إلى قطرة من 20% استون على شريحة زجاجية 2- تسخن بلطف على صفيحة ساخنة او على لهب هادئ لبسط القطاعات ولتجف 3- تغمر القطاعات في محلول صبغة أزرق الميثلين او ازرق التلوين لمدة 30 ثانية الى 2 د. ثم تسخن بلطف 4-ثم تغسل الشرائح بالماء المقطر ثم تجفف في مكان دافئ. 5- تطمر القطاعات بقطرة من مادة الطمر البلاستيكية ثم تغطى بغطاء الشريحة 6- ثم بعد أن تجف تفحص بواسطة المجهر الضوئي لمعرفة تركيب أجراء القطاع ليسهل دراسته بالمجهر الإلكتروني . د. عمر عبد القادر

د. عمر عبد القادر