לכל אחת מארבעת המעבדות יש להביא: 1)חלוק. 2)טושים לא מחיקים (פנטלים). 3)טבלאות עבודה, גרפים וכו' – ע''פ הנדרש יש להגיע מוכנים לבוחן קצר שיערך לפני תחילת העבודה ואשר תפקידו לוודא את הבנת החומר ברמה העקרונית והטכנית. ציון המעבדה : בחנים 30% דו"ח ראשון 20% דו"ח שני 40% התרשמות: טבלאות עבודה, עבודה במעבדה, השתתפות בדיונים. 10%

מעבדות הקורס ביוכימיה מורחב, תרשים זרימה: מעבדה מס' 1: הפקת ממברנות עשירות ברצפטור  2 אדרנרגי. מעבדה מס' 2: קביעת חלבון mg/ml בשיטות: Lowry ו- Bradford. מעבדה מס' 3: קביעת מספר אתרי הקישור לקלונידין(=מספר ברצפטורים 2  אדרנרגים). קביעת קבוע הדיסוציאציה (Kd) של קלונידין מהרצפטור. מעבדה מס' 4: קביעת Kd של ליגנדים שונים לרצפטור ה -  2 אדרנרגי על ידי נסיונות הדחת קלונידין מהרצפטור.

הפקת ממברנות ממח פרה : 1) מח פרה (חוץ מהצרבלום) נחתך לקוביות, חולק לאפנדורפים, הוקפא בחנקן נוזלי ואוכסן ב C. החל משלב זה יש להקפיד לעבוד ב- 4 0 C למניעת פעילות פרוטאזות. 2) פיצוץ התאים: א) הומוגניזציה = פיצוץ מכאני. ב) בופר היפוטוני. פונקציות הבופר: היפוטוניות חוזק יוני (Mg 2+ ), שמירה על מבנה הממברנה העוטפת את הרצפטור על ידי ניטרול המטענים השליליים של ראשי הפוספוליפידים ומניעת הדחייה בינהם. שמירה על pH 7.5. H2OH2O C-NH 3 + HOCH 2 C-NH 2 + H + Tris pKa= 8.3 OH- pH pKa pH = pKa + log [A - ] / [AH] תחום פעילות בופר: pKa +/-1 ריכוז הבופר: צריך להיות גדול מהשינויים ב- pH שעתידים להתרחש במהלך ההפקה והוא נקבע נסיונית.

במה תלוייה מהירות ההשקעה של חלקיק? מסת החלקיק. צפיפות החלקיק. צורת החלקיק. צפיפות הממס. 3) הפרדת ממברנות פלסמטיות- סרכוז ראשון (1000 rpm, 5’). P1 (משקע) - גרעינים, פרגמנטים גדולים, מיטוכונדריה. S1 (נוזל) – ריבוזומים, ממברנות, חלבונים. לשמור!!! להרחיף את המשקע ולסרכז שוב. לצרף את שני ה- sup ולזרוק את המשקע. 4) סרכוז שני (14,000 rpm, 20’). P2 (משקע) – ממברנות פלסמטיות. לשמור!!! S2 (נוזל) – ריבוזומים, ממברנות ER,חלבונים משוחררים. לזרוק. להרחיף את המשקע ולסרכז שוב 5) הרחפת המשקע ב- 6 ml בופר A. חלוקה למנות של 1.2 ml (4 מבחנות) ml מבחנה נוספת מסומנת. הקפאה בחנקן נוזלי.

למה ממברנות שונות בתא שוקעות בשלבים שונים? הדבר תלוי בגודל הוסיקולות שנוצרות אחרי שבירת הממברנה. ER יוצרות וסיקולות קטנות לעומת ממברנות פלסמטיות שיוצרות וסיקולות גדולות. היחס בין גודל ראש הפוספוליפיד לאורך הזנב קובע את גודל הוסיקולות שנוצרות. ב- ER יש הרבה פוספוטידיל אינוזיטול שהוא בעל ראש גדול ולכן נוצרות וסיקולות קטנות. בממברנה הפלסמטית יש הרבה פוספוטידיל סרין שהוא בעל ראש קטן ולכן נוצרות וסיקולות גדולות.

לשבוע הבא... קביעת ריכוז חלבון המטרה: קביעת ריכוז סה''כ החלבון בממברנות כדי שישמש מדד להשוואה בין נסיונות שונים. למה קובעים ריכוז חלבון? שיטות: 280 nm. Biuret Lowry Bradford עקום כיול: מתאר את הקשר בין בליעת האור לכמות החלבון. A =  *L*C A- הבליעה באורך גל מסוים. ( ). L- אורך הדרך האופטית. (1 cm). C- ריכוז החלבון.  - קבוע הבליעה של החלבון באורך גל מסוים. האם חשוב מה הוא חלבון הסטנדרט? מה עקרונות השיטות? מה היתרונות והחסרונות?  g BSA OD