张少敏 03081028. 目前常用的有四种古老的经典方法 : 定氮法, 双缩脲法 ( Biuret 法 ) Folin - 酚试剂法 ( Lowry 法 ) 和紫外吸收法. 另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法, 考马斯亮蓝法 ( Bradford 法 ). 其中 Bradford 法和.

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张少敏

目前常用的有四种古老的经典方法 : 定氮法, 双缩脲法 ( Biuret 法 ) Folin - 酚试剂法 ( Lowry 法 ) 和紫外吸收法. 另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法, 考马斯亮蓝法 ( Bradford 法 ). 其中 Bradford 法和 Lowry 法灵敏度高，比紫外吸收法高倍, 比 Biuret 法高 100 倍以上. 凯氏定氮法比较复杂, 但较准确, 往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质.

下面只简单介绍凯氏定氮法和考马斯亮蓝法一. 微量凯氏定氮法样品与浓硫酸共热, 含氮有机物即分解产生氨, 氨又与硫酸作用变成硫氨. 经强碱碱化使之分解放出氨, 借蒸汽将氨蒸至酸液中, 根据此酸液被中和的程度可计算得样品氮的含量. 以甘氨酸为例 :

H 2 NCH 2 COOH +3H 2 SO 4 → 2CO 2 + 3SO 2 + 4H 2 O + NH 3 (l) (1) 2NH 3 +H 2 SO 4 → (NH 4 ) 2 SO 4 (2) (NH 4 )SO 4 +2NaOH → 2H 2 O+Na 2 SO 4 +2NH 3 (3) 此法灵敏度低, 适用于 mg 氮, 误差为 2%, 费时 8-10 小时, 将氮转化为氨, 用酸吸收后滴定.

二. 考马斯亮蓝法 1). 原理 1976 年由 Bradford 建立的考马斯亮蓝法, 是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一. 考马斯亮蓝 G-20 染料, 在酸性溶液中与蛋白质结合, 使染料最大吸收峰位置, 由 465nm 变为 595nm, 溶液的颜色也由棕黑色变为兰色. 染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合. 在 595nm 下测定的吸光度 A595, 与蛋白质浓度成正比.

Bradford 法的突出特点 : (1) 灵敏度高. 其最低检测蛋白质含量可达 1mg, 这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大, 蛋白质 - 染料复合物有更高的吸光系数, 因而光吸收要比 Folin – 酚试剂法大得多. (2) 测定快速, 简洁, 只需要加一种试剂. 完成一个样品的测定, 只要 5 分钟左右. 由于染料与蛋白质结合的过程, 大约只要 2 分钟即可完成, 其颜色可以在 1 小时内保持稳定, 且在 5 分钟至 20 分钟之间, 颜色的稳定性最好. (3). 干扰物质少.

zzzzzz 此法缺点 : (1). 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的偏差. (2). 仍有一些物质干扰此法的测定, 主要的干扰物质有去污剂等 (3). 标准曲线也有轻微的非线形, 因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度.

( 二 ) 试剂与器材 1. 试剂 : (1) 标准蛋白质溶液, 用 G- 蛋白或牛血清蛋白 ( ), 配制成 1.0mg/ml 和 0.1mg/ml 的标准蛋白质溶液. (2) 考马斯亮兰 G-250 染料试剂 : 称 100mg 考马斯亮兰 G-250, 溶于 50ml 95% 的乙醇后，再加入 120ml85 % 的磷酸, 用水稀释至 1L

2. 器材 (1) 可见光分光光度计 (2) 旋涡混合器 (3) 试管 16 支 ( 三 ) 操作方法 1 标准方法 (1) 取 16 支试管,1 支作空白,3 支留作未知样品, 其余试管分为两组, 按表中顺序, 分别加入样品, 水和试剂, 即用 1.0mg/ml 的标准蛋白质溶液给个试管分别加入 :0,0.01,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1ml, 然后用水补充到 0.1ml 最后各试管中分别加入 5.0ml 考马斯亮蓝 G-250 试剂. 未知样品见表中的 8, 9,10 管

(2) 加完试剂 2-5 分钟后, 即可开始用比色皿, 在分光光度计上测定各样品在 595nm 处的光吸收值 A595, 空白对照为 1 号管. 注意 : 不可用石英比色皿 ( 因不易洗去染料 ) (3) 用标准蛋白质 (mg) 为横坐标, 用吸光值 A595 为纵坐标, 作图, 即得一标准曲线. 由此标准曲线, 根据测出的为止样品 A595 值, 即可查出样品蛋白质含量.0.50mg 牛血清蛋白 /ml 溶液约为 0.50.

管号蛋白质（ mg/ ml ）蒸馏水考马斯亮兰 5.0

2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时 (10-100mg/ml) 可将取样 ( 包含补加的水 ) 加到 0.5ml 或 1.0ml, 空白对照则分别为 0.1ml 或 1.0mlH2O, 考马斯亮兰 G-250 试剂仍加 5.0ml, 同时作相应的标准曲线, 测 595nm 的光吸收值. 0.05mg 牛血清蛋白 /ml 溶液 A595 约为 0.29

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