Analysis of Vitamines 第十章 维生素类 药物的分析 药物分析教研室

Contents A B1 Vitamins C D E

第一节 VitA 9 1 2 3 4 5 6 7 8 Retinol (Vit A alcohol) VA acetate VA polmitate 2-Cis Neovitamin Aa 4-Cis Neovitamin Ab 2,4-dicis Neovitamin Ac 6-Cis Isovitamin Aa

第一节 VitA 一、主要性质 二、鉴别试验 溶解性 不稳定性 紫外吸收 与三氯化锑呈色 1.三氯化锑反应(Carr-Price反应) SbCl3 CHCl3(无水无醇) 蓝色 紫红色

第一节 VitA 2.UV Vit A3 3.TLC Vit A

第一节 VitA 三、含量测定 1g pure VA acetate ≈ 2.907×106I.U. Vit A 含量表示——效价(I.U./g) International Unit Vit A acetate——效价(I.U./g) 2.907×106 1g pure VA acetate ≈ 2.907×106I.U. VA alcohol—— 3.33×106

第一节 VitA 测定原理 A nm 杂质的吸收在310~ 340 nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小； 物质对光的吸收具有加和性。 A Vit A sample pure VA acetate impurities nm

第一节 VitA VitA醋酸酯 nm A 设： 已知 λ2 λ1 λ3 第一法——等波长法 Vit A sample pure VA acetate impurities 设： A1 A3 A2 Aλ1 已知 Aλ1=A1-X1=A1-(mλ1+C) Aλ2 Aλ3 Aλ2=A2-X2=A2-(mλ2+C) Aλ3=A3-X3=A3-(mλ3+C) Y=mX+C X2 X1 X3 λ2 λ1 λ3 A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340) 316 328 340

第一节 VitA VitA醇 A λ2 λ1 λ3 nm 第二法——等吸收比法 Aλ2=Aλ3=6/7Aλ1 A325(校正) D E F L M VitA醇 310 325 334

测定方法 一、基本步骤 第一步：选择A （A328 或A328(校正后)） 第二步：求 第三步：求效价

测定方法 1IU=0.344μg Vit A 醋酸酯 1gVit A 醋酸酯=106 μg/0.344 (μg/IU) Vit A 醋酸酯换算因子 =2.907×106 IU/1530 =1900

测定方法 第四步：求标示量

测定方法 二、第一法——纯度高的VitA acetate λmax应为328nm。 计算 ，选择A 合成 Vit A 天然鱼肝油 ① ② ③ 计算 ，选择A

测定方法 A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340) ◊ ◊ ◊ A. 若【(Aλ/A328nm)-规定值】≤ (±0.02) —— A328不校正 B. 若【(Aλ/A328nm)-规定值】 有超过 (±0.02)者 A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340) A328不校正 ◊ A=A328校正 ◊ 第二法 ◊

测定方法 三、第二法——VitA alcohol 酯 乙醚提取VA醇，洗涤，过滤 异丙醇溶解残渣 皂化法 6/7法 ① 样品前处理 酯 乙醚提取VA醇，洗涤，过滤 异丙醇溶解残渣 在 300，310，325，334nm处分别测Ai ② λmax应为325nm。 若λmax不在323～327nm之间，则供试品中杂质含量过高，改为色谱法将未皂化部分纯化后进行测定。 ③ 计算 ，选择A

测定方法 A325(校正)=6.815A325-2.555A310-4.260A334 ◊ ◊ 色谱法 B. 若(A300/A325)> 0.73 色谱法

测定方法 应用示例一 VitAD胶丸中VitA的含量测定 精密称取本品(规格10,000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物 0.1287g 至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度如下，计算Vit A的标示量百分含量。

测定方法 A=A328校正

测定方法

测定方法 应用示例二 称取Vit A滴剂0.1082g(标示量50 000I.U./g)，加环已烷至50.0ml，取出5.0ml置于另一50 ml量瓶中，加环已烷至刻度，摇匀后置石英比色皿中，以环已烷为空白，分别于以下波长处测得相应的吸收度值，试求此滴剂中Vit A的标示量百分率：

测定方法 A=A328校正

测定方法

第一节 VitA 缺点 呈色不稳定 （5 ~ 10s内） 水分干扰 与标准曲线温差≤1℃ 专属性差 三氯化锑有腐蚀性 (二)三氯化锑比色法 λmax 618nm～620nm 缺点 呈色不稳定 （5 ~ 10s内） 水分干扰 与标准曲线温差≤1℃ 专属性差 三氯化锑有腐蚀性

第一节 VitA 色谱条件 (三)HPLC RF-HPLC同时测定人血清中Vit A和Vit E含量 Vit A Vit E 色谱柱：C18 流动相：甲醇-水 流速：1.2ml/min 检测波长与AUFS： 0～8min(330nm,0.25AUFS); 8min后(292nm,0.05AUFS) 内标：Vit A 酯 Vit A Vit E

第二节 VitB 氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵碱) 与生物碱沉淀剂反应 溶解性 氯化物特性 硫色素反应 紫外吸收 Vit B1(Thiamine Hydrochloride) 氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵碱) 溶解性 硫色素反应 紫外吸收 与生物碱沉淀剂反应 氯化物特性

第二节 VitB 一、Identification 1.硫色素荧光反应——为维生素B1所特有 NaOH －H2O

第二节 VitB 环合 [O] －2H 硫色素 Thiochtome 溶于丁醇，显蓝色荧光

第二节 VitB 2.硝酸铅反应——S元素反应 3.生物碱沉淀剂发生沉淀反应 4.氯化物反应 取本品约5mg，加NaOH T.S. 2.5ml溶解后，加铁氰化钾 T.S. 0.5ml与正丁醇5ml，强力振摇2min，放置使分层，上层显强烈的蓝色荧光；加酸使呈酸性，荧光即消失；再加碱使呈碱性，荧光又重现。 2.硝酸铅反应——S元素反应 3.生物碱沉淀剂发生沉淀反应 4.氯化物反应

第二节 VitB 二、Assay 非水溶液滴定法 (Non-aqueous Titrimetry) 紫外分光光度法 (UV) 硫色素荧光法 (Thiochrone Fluoremetry)

第二节 VitB 1. Non-aqueous Titrimetry 喹那啶红－亚甲蓝 （紫红→天蓝）

第二节 VitB 2. UV 1——0.1M HCl 2——H20 3——H3PO4 buffer 4——alcohol 246 232 255

第二节 VitB S d A b 3. Thiochrone Fluoremetry + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 对照液 λex-365nm λem-435nm VitB1 铁氰化钾 NaOH 硫色素 异丁醇 荧光 S d A b + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇 对照液 + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇 供试液

第三节 VitC 6 1 2 3 4 5 ﹡ 内酯结构 ﹡ 共轭 酸性强 酸性弱 烯二醇结构

第三节 VitC 一、主要性质 溶解性 酸性 旋光性 还原性 L-抗坏血酸 L-去氢抗坏血酸 L-二酮古罗糖酸 (有生物活性) 无生物活性

第三节 VitC 水解性 糖类性质 50℃ UV

第三节 VitC 二、鉴别 1.与AgNO3反应 2.与2,6-二氯靛酚反应 酸式色 碱式色 氧化型 还原型 3.与氧化剂反应

第三节 VitC 4.与糖类反应 H2O -CO2 戊糖 -3H2O 糠醛 50℃ 蓝色

第三节 VitC 三、含量测定(强还原性) 1.碘量法 取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6

第三节 VitC 2. 2,6-二氯靛酚滴定法 3.HPLC 人血浆中Vit C浓度的HPLC法测定

第三节 VitC 标准溶液制备：取V C对照品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加10%偏磷酸稀释至刻度，得维生素C储备液浓度为1mg/ml，置冰箱中2℃保存，3日内可用。 血浆样品预处理：取受试者静脉血，立即置肝素化的离心试管中，3000rpm离心5min；取血浆0.5ml，加入0.5ml 10%偏磷酸溶液，涡旋混合0.5min，离心，分取上清液，置冰箱2℃贮存，直至测定。 稳定性考察：V C在血浆中不稳定，在5%偏磷酸溶液中也难以保持长期稳定，应尽可能缩短药物分离和处理时间。 样品测定：每天抽取的血样应当日测定，每天建立一条标准曲线，并随行测定高、中、低浓度的双样本质控样品。

第四节 Vit D 胆甾醇 7-脱氢胆甾醇 维生素 D3 麦角甾醇 维生素 D2

第四节 Vit D 维生素D2 维生素D3 溶解性 不稳定性 旋光性 显色反应 紫外吸收

第四节 Vit D 二、鉴别 三、杂质检查 四、含量测定 1、麦角醇的检查 90％乙醇溶解后，加洋地黄皂苷溶液，放置18h，不得发生浑浊。 1、麦角醇的检查　　　　 　　90％乙醇溶解后，加洋地黄皂苷溶液，放置18h，不得发生浑浊。 2、前维生素D的光照产物 　　　　λ＝280nm~320nm 四、含量测定 Ch.P 2005——NP-HPLC

第四节 Vit D 固定相：硅胶 流动相：正己烷－正戊醇（997：3） 检测波长：254nm 第一法：用于无维生素A醇及其他干扰的供试品 第二法：(1)皂化提取 ;(2)净化用色谱柱系统分离收集维生素D，得供试品溶液B;(3)按第一法进行测定。 第三法：当样品经皂化提取及净化用色谱系统分离收集后，前维生素D峰仍受干扰时，采用此法。

第五节 Vit E ﹡ Vit E (dl-α-Tocopheryl Acetate) 苯并二氢吡喃醇 Synthetic Natural

第五节 Vit E 苯并二氢吡喃环 + 饱和烃链 溶解性 水解性 氧化性 紫外吸收 二、鉴别 生育酚 （橙红色） 生育红 △ HNO3 1.硝酸反应

第五节 Vit E [O] 生育酚 对-生育醌 0.01%无水乙醇中，λmax = 284nm，λmin = 254nm 2.三氯化铁反应 3.UV 0.01%无水乙醇中，λmax = 284nm，λmin = 254nm

第五节 Vit E VitE Rf = 0.7 4.三氯化铁反应 薄层板 硅胶G 展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1） 展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1） 显色剂 硫酸（105℃ 5′） VitE Rf = 0.7

第五节 Vit E 三、杂质检查 1.酸度 2.生育酚 取Vit E 0.1g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺T.S.1滴，用硫酸鈰滴定液(0.01mol/L)滴定，消耗硫酸鈰滴定液(0.01mol/L)不得过1.0ml

第五节 Vit E 四、含量测定 24.40´内标 1.GC——Ch.P 14.54´VE 载气→N2 固定液→硅酮（OV-17） 担体→硅藻土或高分子多孔小球 柱温→265℃ 检测器→氢火焰离子化检测器(FID) 内标→正三十二烷 n ≥ 500 R≥2 USP 内标 十六酸十六醇酯 R≥1.0

第五节 Vit E 内标液 取正三十二烷加正己烷溶解并稀释成1.0mg/ml溶液 对照液 精密称取VitE对照品0.2011g置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液10ml，密塞，振摇使溶解，取 1~3μl注入GC仪，测定，计算校正因子 供试液 精密称取供试品0.1998g置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液10ml，密塞，振摇使溶解，取1~3μl注入GC仪，测定，计算含量。 已知：对照液测得A对=297456，A内=797469； 供试液测得A样=296513，A内=805741; 本品含C31H52O3应为96.0 ~ 102.0%

第五节 Vit E

第五节 Vit E 2.HPLC——JP 样品→ dl－α－生育酚 固定相→十八烷基硅烷键合硅胶 流动相→甲醇-水（49 ：1） 流动相→甲醇-水（49 ：1） 检测波长→292nm R＞2.6 RSD≤0.8% 3.FLD——同步荧光扫描法

第六节 复方制剂中维生素的分析 一、离子对HPLC测定维生素 离子对试剂 水溶性 脂溶性 抗氧剂 色谱柱→ODS 流动相→A: MeOH:H2O=(200:800)[含1.1615g樟脑磺酸] B: MeOH 检测波长→脂溶性:280nm；水溶性:272nm 内标→苯酚 水溶性维生素供试液配制 取维生素片粉，精密称定，置棕色量瓶中，加DMPS 100μl，内标液5ml，流动相A溶解稀释至刻度，摇匀，过滤，备用。 取维生素片粉，精密称定，置棕色量瓶中，加DMPS 100μl，甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，过滤，备用 离子对试剂 水溶性 脂溶性 抗氧剂

第六节 复方制剂中维生素的分析 二、RP-HPLC测定水溶性维生素 色谱柱→ODS 流动相→A: buffer(0.05M KH2PO4,0.2% 三乙胺,pH6.0):ACN =(97:3) B: MeOH 梯度洗脱程序→(0min)A:B(90:10)→ (20min)A:B(60:40) → (30min)A:B(90:10) 流速→1.0ml/min 检测波长→210nm 柱温→室温

第六节 复方制剂中维生素的分析 三、非水RP-HPLC测定脂溶性维生素 色谱柱→ODS 流动相→ACN:MeOH=(80:20) 流速→1.0ml/min 检测波长→265nm

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