טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים 2. שיבוט cloning - : טכניקה לבידוד מקטע DNA 3. ריצוף DNA (sequencing) 4. PCR 5. microarray )ביו-ציפ (.

אנזימי רסטריקציה

Cohesive = מתלכד 5’ overhang 3’ overhang

cloning

polylinker

פלסמיד השיבוט

Plasmid cloning

Plasmid cloning

האם ניתן לשבט מקטע דנא שנחתך בשתי קצוותיו באינזים שחותך קצה ישר (blunt ends) לתוך פלסמיד שגם הוא נחתך עם אותו אינזים רסטריקציה? אי אפשר כי אין נקודת אחיזה אפשר כי מבחינה הסתברותית קצה ישר יגיע למגע עם קצה ישר שני

כמה אפשריות חיבור (אורינטציות) יש בין פלסמיד שנחתך באינזים רסטריקציה שיוצר קצוות ישרים (blunt) לבין רצף שני של DNA שנחתך באותו אינזים 1. אחד 2. שניים 3. שלוש 4. ארבע

טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים 2. שיבוט 3. ריצוף DNA (sequencing) 4. PCR (polymerase chain reaction) 5. microarray ביו-ציפ.

Taq polymerase

PCR – polymerase chain reaction 30 sec for 1Kb = elongation

PCR first PCR-2 PCR In vitro mutagenesis / site-directed mutagenesis – מומלץ לצפייה Creating transgene mouse

Site-directed mutagenesis

The PCR product on the gel

עזרה בתרגיל http://www.tau.ac.il/~gilast/ F R תרגיל בשיבוט-2010 אורך פריימר לא פחות מ-18 בסיסים תכנון פריימרים למוטציה שונה מתכנון פריימרים להגברת מקטע כלשהו ביום ראשון לא יהיה שיעור

PCR PCR first PCR-2 In vitro mutagenesis / site-directed mutagenesis Creating transgene mouse

טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים 2. שיבוט 3. ריצוף DNA (sequencing) 4. RCP 5. microarray ביו-ציפ.

DNA sequencing

ריצוף דנא - SEQUENCING

DNA sequencing gel

DNA sequencing

מכשיר ריצוף DNA אוטומטי

ריצוף הגנום האנושי

גרג וונטר

Deep sequencing: the technology

טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים 2. שיבוט 3. ריצוף DNA (sequencing) 4. RCP 5. microarray ביו-ציפ.

Principle of Microarray (Chip) Assay Prehybridization Posthybridization Synthetic DNA probes Probes with hybridized DNA

Screening microarray

microarray Genome microarray

כל נקודה מצינת גן מאוקטב. סוג הצבע ורמתו מיצגים את רמת הפעלת הגן

ChIP-on-chip TF TF Antibody Binding sites Genomic Arrays We use a strategy known as ChIP-on-chip. As shown in this slide, a population of cells are treated with formadehyde to crosslink the DNA binding protein and their substrate in vivo. Then we sonicate the genome to break up the chromosome into small fragments, and use an antibody the specifically recognize the transcription factor to purify the complexes from the cell extract. This is known as ChIP, first invented by John Lis more than 2 decades ago. The second chip standards for microarrays, which are used to identify the enriched DNA sequneces. are then amplified, fluorescently labeled and identified through hybridization to a DNA microarray containing genomic sequneces for the orgnanism. The DNA microarray data is analyzed by statistics method and the target sites are can be simultaneously identified. Genomic Arrays

ChIP-seq in a nutshell

Oligo tiling arrays To demonstrate the accuracy and efficiency of this approach, we first try to identify promoters in the human genome. Since promoters are bound by the basal transcription machinery upon activation, we tried to define promoters by determining the binding sites of RNAP complex along the genome.

טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים 2. שיבוט 3. ריצוף DNA (sequencing) 4. PCR 5. microarray ביו-ציפ.

היברידזציה

Gel electrophoresis ג'לים 1. ג'ל דנטורטיבי חלבונים – SDS 2. ג'ל דנטורטיבי DNA או RNA – אוראה או פורמאמיד 3. ג'ל נטיבי (מצבו הטיבעי של חלבון/DNA/RNA בתא) לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-RNA או DNA לא מוסיפים חומרים הגורמים לדנטורציה.

הפרדות על גבי ג'לים

Gel electrophoresis ג'לים 1. ג'ל דנטורטיבי חלבונים – SDS 2. ג'ל דנטורטיבי DNA או RNA – אוראה או פורמאמיד 3. ג'ל נטיבי (מצבו הטיבעי של חלבון/DNA/RNA בתא) לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-RNA או DNA לא מוסיפים חומרים הגורמים לדנטורציה.

Native gel

תרגיל בשיבוט – ד.נ.א רקומבינטיבי 1. הוטל עליך לשבט חלק מהרצף הגנומי של הגןsurvival of motor neuron 1 (SMN1) מאקסון 7 עד אקסון 9 (כולל). הרצף המופיע בתמונה הוא רצף pre-mRNA הנגזר מתוך הרצף הגנומי העומד לרשותך (האם ה-3’ UTR הוא חלק מאקסון 8?). 2. כמו כן לרשותך פלסמיד אשר לתוכו תשבט את הרצף הנדרש באתר ה- polylinker (תמונה 2). 3. במעבדה שלושה אינזימי חיתוך (רסטריקציה) ואתרי החיתוך שלהם מופיעים בתמונה מספר 3. 4. כמו כן במעבדה קיים האנזים RNA polymerase T7 בלבד שישמש אותך בהמשך המחקר בסנטזת ה-ר.נ.א של הגן המשובט. 5. כיצד תשבט את אקסון 7 עד 9 (כולל) של הגן SMN1 : פרט כל שלב ושלב (מהגברת מקטע הגן עצמו ועד שלב הפקת הפלסמיד), באיזה אנזימים תשתמש, רשום את רצף שני הפריימרים שתזמין, ומה יהיה עליך להזמין בנוסף על כך ? 6. מה יהיה עליך לעשות על מנת לקבל את ה pre-mRNA של הגן (אך ורק אותו!) ? הערה: ניתן לסנטז את ה pre-mRNA במבחנה (in-vitro), אז כיצד תסנטז את רצף ה-pre-mRNA מבלי לסנטז את רצף הפלסמיד שנמצא downstream לאקסון מספר 9? במעבדה ישנו מכשיר PCR, קיט תעשייתי להפקת פלסמיד (מאפשר להפיק פלסמיד מכמות גדולה של חיידקים) וכמו כן ניתן להזמין פריימרים (רצפי התחל). ראקציית ה- PCR מתבצעת ע"י ערבוב החומרים והכנסתם למכשיר ה- .PCR

תמונה 1: רצף גנומי חלקי של הגן survival of motor neuron 1 . (SMN1) Exon – red upper case Intron – black lower case Amino acids –under the center of the codon

תמונה 2: פלסמיד השיבוט polylinker

תמונה 3: אתרי חיתוך של שלושה אינזימי רסטריקציה Products generated by restriction enzymes Cohesive ends 5’ G AATTC 3’ 3’ CTTAA G 5’ EcoRI 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ BamHI 5’ GGATCC 3’ 3’ CCTAGG 5’ 5’ G GATCC 3’ 3’ CCTAG G 5’ XhoI 5’ CTCGAG 3’ 3’ GAGCTC 5” 5’ CTCGA G 3’ 3’ G AGCTC 5’