基于 DArT 技术的杜仲遗传多样 性及基因型识别研究 姓名：洪义欢 学号： D08034 导师：陈建民教授

1 、研究背景及意义 2 、研究目标 3 、研究内容 4 、拟解决的关键问题及可行性分析 5 、本研究的特色与创新之处 6 、年度研究计划及预期研究结果 7 、研究基础

杜仲自古便以名贵中药材而 著称 传统中药中主要以皮为主， 收获方式以砍伐剥皮为主， 造成杜仲种质资源的严重破 坏和丢失。 1 、研究背景及意义 杜仲浑身是宝，可根据不同用 途选育优良树种 ( 药用成分含 量高、含胶量高、产皮量高、 速生等 ) ，但是参照标准很难 确定，开发受限。

面临的危机： 杜仲种质资源濒临灭绝。 优良树种的选育困难。 研究方法的选择 ： 对杜仲的遗传多样性进行分析 采用现代分子生物学方法

了解物种起源、 预测种源适应性、 估算基因资源分布、 进行种质资源开发与利用、 确定核心种质并保存、 进行杂交育种的亲本选择 遗传多样性的研究意义

不受季节、环境、组织、器官及植物 发育阶段的限制； 不影响目标性状的表达； 多表现为共显性，可以十分方便的对 隐性性状进行选择； 不受基因表达与否的限制； 在基因组上分布广、数量多 ( 几乎是无 限的 ) ； 所需要的材料少。 现代分子生物学方法的优点

利用现代分子生物学方法对杜仲遗传 多样性研究还处于非常低级的水平， 查阅相关文献，仅寥寥数篇。 对杜仲的种质资源及遗传多样性研究 结果也不够确定。 研究水平：

找寻一个合适的分子生物学研究方法 显得尤为重要。 研究杜仲的遗传变异、杜仲的演变进 化、杜仲栽培类型的分组、杜仲种质 资源开发与利用、确定杜仲核心种质 并保存、进行杂交育种的亲本选配。 研究意义：

DArT （ Diversity arrays technology ） 方法的优点：  高通量的特点；  一个阵列可同时检测发布在基因组中 的几百个多态性位点；  不需要预先知道 DNA 序列信息 ;  重复性稳定，实验可靠，受染色体倍 数性和基因组大小的影响很小；  低成本。

DArT 应用了微阵列平台技术

（ 1 ）分析杜仲在不同居群内部及居群间的遗传 分化情况，为杜仲种质资源的遗传多样性及保 护提供基础资料和对策。 （ 2 ）为栽培杜仲的基因型鉴定提供分子标记， 为优良杜仲居群的扩繁和进一步选育杜仲优 良品种提供遗传基础。 （ 3 ）从细胞水平探讨杜仲的遗传多样性，为构 建不同产地杜仲的亲缘关系提供形态学证据。 2 、研究目标

（ 1 ）利用 DArT 方法获得具有多态性的分 子标记 （ 2 ）多态性的分子标记分析杜仲不同居群 内部及居群间的遗传分化 （ 3 ）通过对不同产地杜仲的花粉和叶片进 行显微和亚显微结构观察，从细胞水平分 析不同产地杜仲的遗传多样性和亲缘关系 3 、研究内容

多样性微阵 列的制作 利用 DArT 方法获得具有多态性的分子标记

多 态 性 分 子 标 记 的 筛 选 利用 DArT 方法获得具有多态性的分子标记

测序 及发 展 PCR 分子 标记 利用 DArT 方法获得具有多态性的分子标记 挑取克隆转化子 测序插入片段的序列信息 设计引物 扩增不同样本基因组 DNA 确定有多态性的分子标记

多态性的分子标记分析杜仲不同居群 内部及居群间的遗传分化 不同居群和不同采样点的杜仲基因组 DNA 发展的多态性的分子标记筛选基因组 DNA 电泳分离 PCR 产物，统计分析条带的多态性 进行系统发生树的构建 确定居群内及居群间的遗传分化情况

细胞水平分析不同产地杜仲的遗传多样性和亲缘 关系 对不同产地杜仲的花粉和叶片进行显微和亚 显微结构观察 利用形态学特征并结合分子标记 研究不同产地杜仲的遗传多样性和亲缘关系

 杜仲的取材代表性 需要了解各个地区的杜仲分布，可通过实 地取材，对材料的来源明确，便于与其药 效分析对应。 4 、拟解决的关键问题及可行性分析

 多样性微阵列的制作 利用接头相匹配的引物对阳性转化子进行扩增， PCR 产物利用 Qiagen 纯化试剂盒纯化或异丙醇沉淀； 干燥后溶于印迹缓冲液中，将每个转化子扩增产物 固定到 20 张相同玻片上，该工作可由上海生物芯片 有限公司帮助完成。

 杂交信号扫描、分析与数据处理 可采用 Affymetrix418 扫描仪进行杂交信号扫描， 相关软件分析杂交点荧光信号强度。 将同一个克隆点与不同探针杂交结果的比较后记录结 果，找出所选材料中具有多态性的克隆转化子。

5 、本研究的特色与创新之处 （ 1 ）选材的独特性 杜仲为独种属科植物，极具药用价值。由于人们的 滥采导致杜仲濒临灭绝。 通过对现在杜仲居群的遗传多样性研究有利于保存 种质资源。 相比于其他植物的遗传多样性研究，有关杜仲的遗 传多样性研究还处于非常低级的水平。

（ 2 ）研究方法的新颖性 国外已经有人成功将此技术应用到水稻、拟南芥、 小麦、大麦等材料中，杜仲未见相关研究报道。 DArT 技术具有优越性，对于亲缘关系稀少的孤立 种属植物材料较其他分子标记更具有适用性。 （ 3 ）为杜仲遗传改良研究和应用提供基础资料， 对杜仲居群的遗传改良研究具有开创性 利用杜仲叶片和花粉的显微和亚显微结构差异 进行杜仲居群的分组，筛选多态性标记与杜仲 形态差异进行相关分析，对杜仲居群进行科学 分组。

6 、年度研究计划及预期研究结果 年度研究计划 － 杜仲的取材； 基因组 DNA 的限制性酶切片段的克隆。 － 杜仲叶片和花粉的显微和亚显微结构观察； 微阵列杂交及信号检测。 － 分离有多态性的分子标记； 不同杜仲材料的亚显微结构差异分析。 － 利用多态性的分子标记筛选不同地区的杜仲材料； 分子标记与亚显微结构相结合对杜仲进行科学分组。

预期研究结果 1. 明确不同地区的杜仲居群之间的遗传多样性； 2. 获得 30 个以上的具有多态性的克隆转化子； 3. 获得 DArT 分子标记转化为依赖于 PCR 的多态 性的分子标记； 4. 分子标记和形态结构差异相结合，对不同地区 的杜仲进行科学分组。

7 、研究基础 工作基础  熟悉掌握了分子生物学方面的大部分技术和细胞 水平上染色体制片及染色体物理定位研究技术。  大麦的耐湿性状的 SSR 分子标记与定位研究，掌 握了多态性分子标记的筛选方法和统计学分析方 法。  多种植物的分子细胞遗传研究，熟悉掌握了在玻 片上进行相关杂交的技术。  在植物细胞形态结构与功能的研究中所使用的显 微和亚显微结构观察技术成熟。

工作条件  本实验室具备分子生物学研究的常用设备：如冷冻 高速离心机、凝胶成像系统、 PCR 仪、核酸杂交炉、 超低温冰箱、自动化光照培养箱、 Beckman 双波长 分光光度仪、荧光光度仪、 Olympus 荧光显微镜等， 可满足本研究中有关的分子杂交等工作的需要。  另外还具备开展植物形态结构研究用的实验设备， 如石蜡切片机、冰冻切片机、各类显微镜等。  扬州大学测试中心有超薄切片机，透射电子显微镜 和扫描电子显微镜及其相应的配套设备，可以满足 本项目亚显微结构的观察。

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