נסיונות הדחה לאפיון קישור של אגוניסטים ואנטגוניסטים לרצפטור 2 α אדרנרגי צורת עקומת ההדחה 50% IC 50 % קישור הרדיוליגנד [I] ריכוז מדיח 50% % קישור הרדיוליגנד קישור ספציפי קישור לא ספציפי Total בעקומת log רואים בבירור את ה- 100% ו -0% IC 50 – ריכוז המדיח עבורו מתקבל 50% קישור. משמעות הדבר אינה שחצי מסה"כ הרצפטורים תפוסים אלא ש50% מהרצפטורים הנקשרים לרדיוליגנד ( קלונידין במקרה שלנו) בריכוזו הנתון ובהעדר מדיח- תפוסים. ערך זה תלוי בכמות הליגנד המסומן Log[I] 0.5 [I] log

יתרונות שיטת ההדחה על פני שיטת הקישור הישיר בקביעת Kd ( Ki) : 1.מציאת Kd עבור ליגנדים רבים ( אגוניסטים ואנטגוניסטים) ללא צורך לסמנם 2.באמצעות הדחה מבודדים את הקישור הלא ספציפי 3.ניתן לקבוע Kd גם לליגנדים עם Kd גבוה הגורם לפירוק הקומפלקס 4.ניתן לקבוע Kd של ליגנדים בעלי ספציפיות קישור לאתרים נוספים מעבר ל- 2α אדרנרגי * שאלה 1 לדו"ח: למה בניסיונות ההדחה שלנו נעשה שימוש בקלונידין חם (חומר סינטטי) ולא נוראדרנלין (חומר טבעי)?

פיתוח נוסחת ההדחה של Cheng and Prusoff משוואת מיכאליס מנטן : B = המשוואה בעיכוב תחרותי : Bi = Kd הולך ועולה עם עליה בריכוז המדיח, B max לא משתנה B - רצפטור קשור - Bmaxמקסימום רצפטורים L - ריכוז ליגנד חופשי Kd - קבוע פירוק הרדיוליגנד בש"מ Ki - קבוע פירוק המדיח בש"מ Bi - רצפטור קשור בנוכחות מדיח I - ריכוז המדיח

חישוב Ki (Kd של המדיח) IC 50 – שמתקבל מעקומת ההדחה [Radioligand] - שאיתו עבדנו בניסוי Kd – שקבענו בניסיונות קישור בנוכחות המדיח ב- IC 50 נבודד את Ki בעיכוב תחרותי - Bmax לא משתנה ו- Kd הולך ועולה עם עליה בריכוז המדיח ככל ש [L] יעלה כך IC 50 יעלה פקטור המגדיל את Kd

ריכוז הקלונידין במעבדות שלנו קרוב ל- Kd אם נעבוד בריכוזי רוויה של קלונידין - נקבל קריאות גבוהות ומדויקות יותר אך מצד שני נקבל קישור לא ספציפי גבוה. אם נעבוד בריכוזים נמוכים - נקבל קישור לא ספציפי נמוך אבל יתקבלו קריאות נמוכות וערכו היחסי של הרעש יעלה בריכוז של קלונידין סביב ה- Kd עקום הקישור כמעט לינארי ולכן כל שינוי בריכוז הקלונידין משנה את B. יש צורך לדייק בפיפטציה! קישור L]] Kd * שאלה 2 לדו"ח הסבר את ההבדלים א. בין Kd ו- IC 50 ב. בין Bmax ו- 100% קישור בניסוי שלנו איזה יחס יתקבל בין 100% לבין Bmax?

מדידת % הקישור 50% Log[I] 0.5 % קישור הרדיוליגנד [I] log 100% 100% קישור = קלונידין ללא מדיח 0% קישור = קישור לא ספציפי – קלונידין עם אפינפרין בריכוז גבוה Total = פילטרים ספוגים בקלונידין מהו תפקיד ה- Total? * בדו"ח: לא לחבר בין הנקודות אלא להעביר את הקו הידני הטוב ביותר

עקומת Scatchard לא לינארית: B/F B שיפוע העקומה קובע את Kd כל שינוי ב – Kd במהלך הניסוי יצור כמה עקומות לינאריות – אך ויזואלית נקבל עקומה אחת לא לינארית B/F B B קעורה קמורה

עקומת Scatchard לא לינארית: 1. אוכלוסיה הטרוגנית של הרצפטורים 2. ראקצית קישור בת מספר שלבים או מספר מרכיבים 3. קואופרטיביות חיובית או שלילית בין אתרי קישור 4. בריכוזים נמוכים של ליגנד הראקציה לא מגיעה לשווי משקל ( Kd כביכול גבוה) * שאלה 3 לדו"ח : ציין בכל אחד מהמקרים איזו עקומה תתקבל ולמה

ליגנד * שאלה 4 לדו"ח : הציעו ניסוי בו תוכלו להבדיל בין אגוניסט לאנטגוניסט לרצפטור שחוצה 7 פעמים את הממברנה ומצומד לחלבון G מבלי לבדוק פעילות. ציירו את עקומות הקישור המתקבלות בניסוי. חלבון G הקשור לרצפטור מחזק את האפיניות של הרצפטור לליגנד (אגוניסט) קישור GTP גורם להפרדת חלבון G ולהעלאת ה- Kd. Kd של אנטגוניסט לא משתנה בעקבות קישורו של GTP, כי חלבון G לא נקשר לרצפטור. ליגנד cpm ]אגוניסט / אנטגוניסט]