Isolation and characterization of bacteria producing substances against gram negative bacteria 組員：郭政儒、盧俊仲 報告時間： 2004/12/28

Framework

土壤採樣 選擇性培養基篩菌 純化細菌 純化放線菌 指標菌測試抑菌效果 過篩處理 SCA TSA, 1/10 TSA

Material

 培養基 Media used to enumerate soil bacteria Tryptic Soy Agar + 100ppm cycloheximide 1/10 Tryptic Soy Agar + 100ppm cycloheximide Media for isolation and enumeration of soil Actinomycetes Starch-Casein agar (kuster and Williams, 1964) Starch KNO 3 K 2 HPO 4 CaCO 3 Agar 10.0 g 2.0 g 0.02 g 15 g Casein(vitamin free) NaCl MgSO 4 ． 7H 2 O FeSO 4 ． 7H 2 O Distilled water 0.3 g 2.0 g 0.5 g 0.01 g 1.0 L

Method

 分離純菌 採樣土壤－陽明山、將軍嶺 ↓ 土壤過篩 (2×2mm) ↓ 取新鮮土壤樣本 1 g ↓ 將土樣加入 9 ml 無菌食鹽水中 (0.85 %) 震盪混合 ↓土壤懸浮液↓ 再以 9 ml 無菌食鹽水做連續稀釋 ↓

震盪懸浮之後取不同稀釋濃度混合液 0.1 ml 置入選擇培養基 ↓ 28 – 30 ℃培養四天並觀察結果 ↓取平板上單一菌落做四區劃線分離純菌↓培養數天後挑出單一菌落↓ 接至 TSA 做繼代培養

 將軍嶺

採土樣的地點 － 將軍嶺

 柏園山莊 另一採樣地點 － 陽明山

陽明山之採樣點

Results

TSA 培養一天

1/10 TSA 培養一天

SCA 培養一天

TSA 培養三天

1/10TSA 培養三天

SCA 培養三天

A. faecalis S. marcescens Y. enterolitica K. pnenmoniae P. vulgaris Ps. fluorescens N.mucosa Ps. aeruginosa E. aerogenes Sal Ent. E. coli E. coli E. cloacae 菌株測試的情形

Ps. aeruginosa E. aerogenes Sal Ent. E. coli E. coli E. cloacae A. faecalis S. marcescens Y. enterolitica K. pnenmoniae P. vulgaris Ps. fluorescens N.mucosa 測試菌株測試的情形 ( 正面圖 )

分離株四區劃線

經純化之分離株

菌落特徵乳白色菌落中心突起邊緣不規則形粉狀表面

革蘭氏染色

孢子染色

 菌種鑑定 此菌為桿狀革蘭氏陽性菌、產孢、 Catalase 反應陽性、有氧狀 態下生長 此菌為桿狀革蘭氏陽性菌、產孢、 Catalase 反應陽性、有氧狀 態下生長 符合此桿狀革蘭氏陽性、產孢的菌屬有 Bacillus sp. 、 Clostridium sp. ，但 Clostridium sp. 為厭氧菌且無 Catalase 故推 測該菌為 Bacillus sp. 符合此桿狀革蘭氏陽性、產孢的菌屬有 Bacillus sp. 、 Clostridium sp. ，但 Clostridium sp. 為厭氧菌且無 Catalase 故推 測該菌為 Bacillus sp.

Discussion

 本次實驗只篩到一株具有些微抑制革蘭氏陰性菌效果的 菌，比起抑制陽性菌菌株難找。其原因可能為 (1) 未大規模取樣，菌相歧異度不夠大、樣本不夠多 (1) 未大規模取樣，菌相歧異度不夠大、樣本不夠多 (2) 抑制革蘭氏陰性菌的菌株本來就較少 (2) 抑制革蘭氏陰性菌的菌株本來就較少 (3) 培養基無法培養出所有的菌，某些帶有抗生素的菌無法 (3) 培養基無法培養出所有的菌，某些帶有抗生素的菌無法 在 TSA 、 1/10TSA 或 SCA 上生長 在 TSA 、 1/10TSA 或 SCA 上生長

 抗陰性菌菌株難以篩到的原因 (1) 細胞壁組成較為複雜。比起一般的陽性菌只有單純的一 層 peptidoglycan ，陰性菌還多了一層 outer membrane ， 使抗生素難以進入菌體作用 (2) 有研究指出，在一些陰性菌中帶有一些抗抗生素的質體， 如 Pseudomonas spp. ，會使抗生素失效，可能也是難以 篩到抗陰性菌抗生素的原因

 本次實驗所篩到的抗陰性菌經由鑑定後發現為 Bacillus sp. ， 對 S. marcescens 、 P. vulgaris 、具有些微的 抑制效果。除了這株菌外，先前還發現另外兩株可能有 抑制效果的陽性菌，但在觀察數天後發現並無抑制的效 果。  本次實驗所篩到的抗陰性菌經由鑑定後發現為 Bacillus sp. ， 對 S. marcescens 、 P. vulgaris 、 Y. enterolitica 具有些微的 抑制效果。除了這株菌外，先前還發現另外兩株可能有 抑制效果的陽性菌，但在觀察數天後發現並無抑制的效 果。  在抑制的菌株中，有些只是生長情形較為不良，其生長 不良的原因除了受到抗生素的抑制之外，也可能接種過 度密集造成兩菌株間競爭養分，而使生長情形不良。

 疑似具抗革蘭氏陰性菌能力的菌株後來失效的原因，可能 是菌株在受到抗生素的抑制之後，開啟了一些抗抗生素 的基因，而使菌株能夠抵抗抗生素的作用。