Сравнительный анализ пространственных структур белков 1. Оценка качества пространственной структуры (по G.Kleywegt, 2000)

Построение пространственной модели белка в результате рентгеноструктурного анализа кристалла не есть точная наука!

Модель зависит от ее авторов: их опыта самокритичности мотивации используемого программного обеспечения Ошибки в модели почти неизбежны!

При высоком разрешении (<1.5 Å) и хороших фазах модель на 95% и более основана на экспериментальных данных (Kleywegt, 2000)

Остальные 5% модели зависят от того, какие программы использовались как моделировался B-фактор (есть свобода выбора) допускались ли альтернативные конформации моделировались ли водороды

Продолжение какие сгущения электронной плотности интерпретировались как молекулы растворителя (воды), а какие – как шум как отнеслись к некристаллографической симметрии: посчитали ли 2е или более копий одной и той же молекулы белка в ассиметрической ячейке –идентичными или –разрешили им отличаться?

При разрешении >2 Å (>90% РСА моделей в PDB) роль воображения авторов модели возрастает!

Задачи, решаемые пользователем PDB Выбор хорошей (лучшей) модели из нескольких моделей одного и того же или нескольких родственных белков Интегральная оценка качества и, следовательно, степень доверия модели Выявление “маргинальных” групп атомов Маргинальные атомы в модели могут быть либо ошибками расшифровки (“отщепенцами”), либо особенными атомами белка (“белыми воронами”)

Основные индикаторы маргиналов 1.Пространственный R-фактор (Jones et al., 1991) 2.Карта Рамачандрана (Ramachandran&Ramachandran, 1965) 3.“Ротамеровость” боковой цепи (Jones et al., 1991) 4.Комфортность окружения атомов (Vriend&Sanders, 1993), в частности, анализ водородных связей 5.Инверсии петидной цепи от C α до следующего C α (pep-flip; Jones et al., 1991, Kleywegt&Jones, 1998)

высокий B-фактор ( >40) странный коэффициент заполнения (напр. 0!?) длины связей углы торсионные углы (не) планарность (неправильная) хиральность (С α, для Thr, Ile – еще и С β ) Другие индикаторы маргиналов

Продолжение недопустимое сближение несвязанных атомов существенное различие B-факторов ковалентно связанных атомов существенное различие конформаций в разных копиях одного и того же белка из ассиметрической ячейки

Пространственный R-фактор (Real Space R, RSR) Характеризует насколько модель атома (-ов) соответствует “экспериментальной” электронной плотности Сумма берется по узлам пространственной решетки в окружении атома (атомов) Хорошие значения: RSR<10% Плохие: >20%

Продолжение ρ эксп восстанавливается по фазам из модели и интенсивностям рефлексов из эксперимента (часто берут взвешенные интенсивности: эксперимент+модель – отсюда разные карты электронной плотности для одной модели) Карты электронной плотности моделей, для которых в PDB есть файл структурных факторов, доступны на сайте Electron Density Server (EDS)

Вариант RSR – коэфициент корреляции между ρ эксп и ρ модели Как и RSR, вычисляется по узлам пространственной решетки Не зависит от значений ρ эксп, а зависит от согласованности изменений ρ эксп и ρ модели Coeff.corr. <0.9 - подозрительно

Еще один вариант RSR – Z-score Для вычисления Z остатка (напр. Ala57) его RSR сравнивается со средним RSR для того же типа остатков (Ala) по выборке из PDB с примерно таким же разрешением (напр Å)

Карта Рамачандрана характеризует насколько конформация плипептидной цепи остатка (псевдо- )энергетически выгодна -180° 0° +180° φ ψ +180° 0° -180°

Концепция “псевдоэнергии” Идея: то, что наблюдается чаще – более энергетически выгодно Реализация: –строим гистограмму интересующего нас параметра по подходящей выборке из PDB –приближаем ее разумной функцией (например, гауссовой) –считаем, что полученный график отражает энергию в зависимости от параметра

81782 остатка на карте Рамачандрана Beta (B) Left helix (L) Alpha(A)

Области на карте Рамачандрана В хорошей модели >90% остатков, не считая Gly, Pro, находятся в предпочитаемой области Классификация областей (PROCHECK): - предпочитаемая (A,B,L) - разрешенная (a,b,l,p) - допустимая (~a,~b,~l,~p) - запрещенная 1CNR, разрешение 1.05

Карта какого остатка? PROLINE

Где Trp, где Ser? TrpSer

Анализ водородных связей В моделях встречается инверсия боковых цепей His, Asn, Gln Asn His Gln

Инверсия (?) в Asn51 гомеодомена №2 Атом ND2 Атом OD1 Атом N6 – донор H Атом N7 – акцептор H ? ? №1 №2 A103 Asn51 Еще в 36 структурах гомеодоменов – так же, как в 1й; еще в 2х – как во второй

Анализ молекул воды. Пример из модели 1CBS HOH376 HOH375 Leu28.CD 3.9Å 4.3Å Может ли HOH376 фиксироваться в одинаковых точках во всех ячейках кристалла!??? Думаю, что нет

Интегральная оценка комфортности окружения остатка В программе WhatCheck рассчитывается Z-score для комфортности окружения каждой боковой цепи Маргиналы – Z-score < -5 Более показательны участки цепи с низким Z, для их обнаружения строится сглаженный график зависимости Z от номера остатка

Статистика конформаций боковых цепей остатков Боковые цепи имеют от 0 (Gly, Ala) до 4х (Lys, Arg) степеней свободы вращения вокруг ковалентных связей Обозначаются χ 1,..., χ 4

Распределение угла χ 1 в моделях PDB Всего в выборке было остатков

Карта углов χ 1 и χ 2 для Leu Ось X: chi_1 (0-360°) Ось Y: chi_2 (0-360°) Всего 6638 остатков Изображены линии уровня плотности числа остатков

Ротамеры - это боковые цепи в типичных для данного типа остатков конформациях У каждого типа остатков (Leu, Trp, Arg и т.п.) свое число ротамеров SwissPDBviewer “знает” ротамеры и может их показать

Примеры грубых ошибок в записях PDB Кристалл не того белка !!! Полностью ошибочная модель (!) Правильно найдены, но неправильно соединены элементы вторичной структуры Участок цепи вписан в электронную плотность с ошибкой

Janin, 1990: в лаборатории очищали и кристаллизовали ретинат-связывающий белок; при РСА обнаружилось, что получился лизоцим …

Две структуры фотоактивного желтого белка рецептора фототаксиса Ectothiorhdospira halophila: почти ничего общего! 1PHY, 2.4 Å McRee et al PHY, 1.4 Å Borgstahl et al. 1995

Хлормуконат циклоизомераза из Alcaligenes eutrophus: совмещенные структуры 1chr и 2chr 1CHR: Hoier et al., 1993 Разрешение 3.00 Å 2CHR: Kleywegt et al., 1996 Разрешение 3.00 Å

Наложение 1CHR_A и 2СHR

Gln20 Ser22 Ala5 Lys16 Gly40 1CHR и 2CHR: пример “сдвига рамки” при расшифровке

Выравнивание последовательностей 1CHR и 2CHR по близости C_alpha атомов при наложении структур

Мог ли пользователь заподозрить ошибку в структуре 1CHR до появления 2CHR?

Server EDS: Real-space R-value vs Residue for 1chr

RSR: пространственный R-фактор для всех остатков структуры 1CHR

1СHR: коэффициент корреляции для RSR

То же – для всех остатков

EDS server: Z-score vs Residue for 1chr Z-score=(RSR- )/sigma

Z-score для всех остатков структуры 1CHR

Real-space R-value vs Residue for 2chr

RSR для всех оснований из 2chr

2СHR: коэффициент корреляции для RSR

То же – для всех остатков

EDS server: Z-score vs Residue for 2chr

Z-score для RSR для всех остатков структуры 2CHR

Packing environmen for 1CHR: “ Second generation quality Z-score plot smoothed over a 10 residue window” (PDBCheck)

1CHR: Arg35 оказался в гидрофобном кармане 2CHR: Arg35 образует одну водородную связь

Наложение участка 5-47 двух цепочек A и B из структуры 1CHR

1CHR 2CHR <1%1 Запрещен ные 1%3 Допустим ые ~a,~b,~l,~p 16%51 Разрешенн ые a,b,l,p 83%270 Типичные Области A,B,L 1.5%10 Запрещен ные 3.5%22 Допустим ые ~a,~b,~l,~p 19%126 Разрешенн ые a,b,l,p 76%492 Типичные Области A,B,L Сравнение статистик по картам Рамачандрана

Сравнение структур 1CHR и 2CHR Statistic1CHR 2CHRComments Crystallo graphic R-value Not very informative Free R- value ???0.264Cannot compare

Продолжение Statistic1CHR 2CHRComments WHAT IF Z-score Ramachandran plot appearance (for 3.0 Å structures) CHR worse than average WHAT IF Z-score rotamer quality (for 3.0 Å structures) CHR worse than average; 2CHR better than average WHAT IF Z-score backbone conformation quality (for 3.0 Å structures) CHR worse than average; 2CHR better than average

Сервисы и программы PDBsum PDB PDBCheck (программа WhatCheck из пакета WhatIf) PDBReport EDS (RSR во всех видах, файлы с электронными плотностями)

Продолжение Ramachandran plots for all types of residues ( Rotamers for all types of side chains (