高效液相层析法 及其在生化研究中的应用 03 级 化学生物专业 李楠

高效液相层析法 （ HPLC,high performance liquid chromatography ）是近二十年来发展起 来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液 相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有 气相层析的全部优点。由于 HPLC 分离能力强、 测定灵敏度高, 选择性高，分析速度快，可在室 温下进行，应用范围极广，无论是极性还是非 极性，小分子还是大分子，热稳定还是不稳定 的化合物均可用此法测定。对蛋白质、核酸、 氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤为有利。

层析法的本质 色谱柱高选择性的高效能的分离作用与高检 测技术的结合。混合组分的样品在色谱柱中分 离的依据是：同一时刻进入色谱柱中的各组分， 由于在流动相和固定相之间溶解，吸附或离子 交换等作用的不同，随流动相在色普柱中运行 时，在两相间进行重复多次（ 103 － 106 ）的分 配过程，使原来分配系数具有微小差别的各组 分产生了保留能力明显差别的效果。进而各组 分在色普柱中移动速度不同，经过一定长度的 色普柱后，彼此分离开，最后按顺序进入信号 检测器，在记录仪上或色普数据机上显示出各 组分的色普行为和谱峰数值。

层析法可用于定性，半定量，定量的测 定。其定性分析的依据是出峰的时间。 而定量的依据是；组分重量或在在载气 中的浓度与检测器的响应信号成正比。 此响应信号指峰面积或峰高，表示为 w i =f i A i, w i 为欲测组分 i 的量， A i 为组分 i 的峰面积， f i 为比例系数 （称校正因子）

高效液相层析法的基本概念和分离理论与经 典的液相色谱法及气相色谱法一致，因而其塔 板理论及动力学理论等都可用于高效液相层析。 ⒈ 高效液相层析仪 典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱 与检测系统三部分。流动相用一高压泵输入。 这种高压泵应满足以下条件： ①流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。 ②能抗溶剂腐蚀。 ③有较高的输出压力，一般要达到 15 － 300kg/c ，也有的高达 800kg/c 。

④泵的死体积要小。梯度洗脱装置必须具备两 台高压泵，一台输送强溶剂，一台输送弱溶剂， 两泵运转速度用电脑控制，并可按一定的要求 改变流动相的组成，以改善分离效果。 一般用微量注射器直接进样，也可采用六通 阀门进样。 HPLC 中所用的检测器最多应用的 是紫外吸收检测 (UV) ，灵敏度可达 ng 水平。此 外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化 学检测器等。

高效液相层析仪的结构简图

⒉ HPLC 的类型与应用 ⑴ 液 - 固吸附层析： 固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的有 硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。 液 - 固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同， 分为 “ 底剂 ” 和洗脱剂两类，底剂起决定基本色 谱的分离作用，洗脱剂起调节试样组份的滞留 时间长短，并对试样中某几个组份具有选择性 作用。流动相中底剂与洗脱剂成分的组合和选 择，直接影响色谱的分离情况，一般底剂为极 性较低的溶剂，如正已烷、环已烷、戊烷、石 油醚等，洗脱剂则根据试样性质选用针对性溶 剂，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分 离异构体、抗氧化剂与维生素等。

⑵ 液 - 液分配层析 ：固定相为单体固定液构 成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅 胶上，经酸洗、中和、干燥活化、使表面保持 一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的 液 - 液层析称为化学键合相层析。另一种利用离 子对原理的液 - 液分配层析为离子对层析。 化学键合层析分： ①极性键合相层析： 固定 相为极性基团，氰基、 氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极性较 小的溶剂。极性小的组份先出峰，极性大的后 出峰，这称为 正相层析法 ，适用于分离极性 化合物。

②非极性键合相层析： 固定相为非极性基团，如十八烷基 （ C 18 ）、辛烷基（ C 8 ）、甲基与苯基等， 流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈 或无机盐缓冲液。最常用的是不同比例 的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起 洗脱作用还可掩盖载体表面的硅羟基， 防止因吸附而至的拖尾现象。极性大的 组份先出峰，极性小的组份后出峰，恰 好与正相法相反，故称反相层析。本法 适用于小分子物质的分离，如肽、核苷 酸、糖类、氨基酸的衍生物等。

⑶ 离子交换层析： 原理与普通离子交换相同。在离子交换 HPLC 中，固定相多用离子性键合相，故 本法又称离子性键合相层析。流动相 主 要是水溶液， pH 值最好在被分离酸、碱 的 pK 值附近。

应用 高效液相层析法适用于分析沸点高，分 子量大，热稳定性差的物质，它们约占 全部有机化合物的 80 ％，现在高效液相 层析法已经在生物化学，生物工程，医 药研究，食品分析，环境污染分析和精 细化工分析中广泛应用。 下面举几个例子 ……

核苷，核苷酸和核酸的分析研究 在高效液相层析法发展中一直处于核心 地位。嘧啶和嘌呤皆为含有 N 原子的杂环 化合物，五种核碱皆在 240 － 280nm 呈现 强的紫外吸收特性，适于用 UVD 检测。 反相键合相色谱作为检测 DNA 合成的有 效手段，已用于分析人工合成 DNA 碎片 的组成。

在反相键合柱上核苷和核碱的分离 a b c (a) 核苷的分离 (b) 核碱的分离 (C) 核苷与核碱混合物的分离 1- 胞苷； 2- 尿苷； 3- 黄苷； 4- 肌苷 ( 次 黄嘌呤核苷 ) ； 5- 鸟苷； 6- 胸苷； 7- 腺 苷； 8- 胞嘧啶； 9- 尿嘧啶； 10- 次黄嘌 呤； 11- 鸟嘌呤； 12- 黄嘌呤； 13- 胸腺 嘧啶； 14- 腺嘌呤

在 C18 柱上分离核苷酸和核苷 1-CDP ； 2-CMP ； 3-UMP ； 4-GDP ； 5-GMP ； 6-C ； 7-ATP ； 8-U ； 9-AMP ； 10-G

生物胺（ Bioamine ）的分析研究 生物胺是生物机体新陈代谢过程产生的 胺类化合物，它们是由肾上腺髓质分泌 的，既属于激素，又是神经递质。此类 化合物的紫外吸收弱不适于生物样品的 微量或痕量检测，现多利用柱前或柱后 的荧光衍生法，使用荧光检测器检测。 一般用反向色谱，反向离子对色谱或阳 离子交换色谱来实现分离。

在胺基键合相柱分离甾体药物 S- 溶剂； i- 溶质 1- 孕甾酮； 2- 雄甾烯二酮； 3 － Δ4- 娠烯 -20β- 醇酮； 4-17-α- 羟基孕甾酮； 5- 肾上腺甾酮； 6- 乙酸可的松； 7- 可的松； 8- 氢化可的松