מעבדה מס' 2 קביעת כמות חלבון מעבדה מס' 2 קביעת כמות חלבון שיטות: שקילת חלבון יבש המופק מנפח נתון של תמיסה חסרונות: רגישות נמוכה מאד (mg) שוקלים מרכיבים אחרים בנוסף לחלבון יתרונות: מתקבל ערך אבסולוטי אם החלבון נקי זו שיטה טובה ביותר.
שיטות ספקטרופוטומטריות שיטות מדידה המתבססות על בליעת אור (אנרגיה), ככל שאורך הגל גדול יותר, כך האנרגיה שלו נמוכה יותר. תחום אורכי הגל המשמש בספקטרופוטומטריה: 200-400nm UV 400-800nm אור נראה (שיטות קולורימטריות) ספקטרום בליעה של חומר מסוים: נעדיף למדוד באורך הגל בו החומר בולע הכי טוב ויש הבדל גדול בבליעה בין 2 הצורות בהן רוצים להבחין. בליעה אורך גל
שיטות ספקטרופוטומטריות ספקטרופוטומטר: A=log I0/I=εlc ε- קבוע בליעה מולרי l – דרך אופטית (1 ס"מ) C – ריכוז החומר. מונוכרומטור 1cm I I0
שיטות לקביעת חלבון 2) בליעה ב-280nm מתבססת על בליעת U.V של שיירים ארומטיים כגון טירוזין וטריפטופן. - שיטה פשוטה ומהירה - רגישה יותר משקילה (0.1mg) חסרונות: - εוריאבילי מאד כי אחוז השיירים הארומטיים בכל חלבון , שונה. גם חומצות גרעין בולעות בתחום זה. ניתן למדוד גם ב-210nm שהוא תחום הבליעה של הקשר הפפטידי אך באורך גל זה בולעים גם קשרים כפולים.
3) שיטת Lowry: א) יוני נחושת עוברים חיזור, תוך קומפלמנטציה עם 4 קשרים פפטידיים. החיזור גורם לשינוי בצבע התמיסה מכחול לורוד בהיר.(בדומה לשיטת Biuret). ב) folin – סריג פוספטי של יוני מולבידן וטונגסטון.הנחושת המחוזרת , מחזרת את יוני המולבידן ועל ידי כך מתקבל שינוי צבע לכחול (עז). הגדלת עוצמת הצביעה= הגדלת רגישות השיטה שינוי מצב החמצון של מולבידן גורם לשחרור חומצה פוספורית מהסריג. לכן דרוש NaOH לסתירת החומצה ו-Na2 CO3 לשמירה על pH=10. ה- Tartarate , מונע שקיעת Cu(OH) . יתרונות: רגישות גבוהה 10µg)) יותר ספציפי לחלבון מאשר קריאה ב280nm- .
חסרונות: - ε רגיש למספר השיירים הארומטיים בחלבון . יכול להוות בעיה אם אחוז השיירים הארומטיים שונה בחלבון הכיול לעומת החלבונים הנבדקים. עדיין עיוות התוצאות ב- 280nm גדול יותר. זמני אינקובציה ארוכים. רגישות לבופרים חנקניים שעשויים לתרום לחיזור. ריאגנט ה-folin אינו יציב ויש להכין טרי לכל ניסיון. הריאגנט יציב ב-pH<7 אך החיזור מתבצע ב-pH=10 לכן יש לבצע ערבוב מהיר! הצבע לא לינארי בריכוזים גבוהים של החלבון.
שיטתBradford : האינדיקטור Coomassie Blue נקשר לחלבון באופן אלקטרוסטטי לשיירים חיוביים ובאמצעות הטבעות הארומטיות שלו לשיירים ארומטיים בחלבון. יתרונות: שיטה רגישה מאד (µg בודדים). מהירה ויעילה הקומפלקס חלבון אינדיקטור יציב.
חסרונות: -רגישות גבוהה לדטרגנטים -רגישות לריאגנטים פחמניים צובע את התא הפוטומטרי. חוסר לינאריות מסוים הדורש שיטת תיקון. DNFB: שיטה רדיואקטיבית : שימוש ב-dinitrofluorobenzene מסומן בטריטיום. הריאגנט עובר אינטארקציה קוולנטית עם שיירי ציסטאין. שיטה רגישה מאד עד ng מכיוון שמבוססת על סימון איזוטופי של החלבון. וריאביליות בין חלבונים יקרה זמן עבודה
שיטת תיקון ל- Bradford
שיטת תיקון ל-Bradford