Leica TCS SP2 Confocal Spectral Microscope ( UV-VIS ) 簡易使用流程 (modified by Dr. Chien) Leica TCS SP2 Confocal Spectral Microscope ( UV-VIS ) 雷射掃描共軛焦分光光譜顯微鏡 簡易使用流程 (modified by Dr. Chien) 因為樣品的差異性頗高, 所以, 本操作流程 僅是提供一套簡易流程, 供使用人員參考. 然而, 最佳的使用控制調整, 應該以您個人 使用中的樣品為唯一準則. 美嘉儀器 – 共軛焦小組 編製 TEL : / 緊急聯絡 : ( 24 hours on-call )

系統簡介 : 共軛焦掃描器 ( 請參考光路圖 ) 可見光雷射系統 及 電路控制系統 UV 雷射 : 另有獨立的供電開關 雷射電源開關 供電電源開關 防震桌 螢光燈源 _ 汞燈 穿透光燈源 鹵素燈 顯微鏡總電源開關反射 / 螢光 及 穿透光光源 的切換開關 影像掃描擷取操控旋鈕 ( Control Panel ) Ar/Kr 雷射調整旋鈕 螢光濾鏡轉盤

多光子 螢光影像 感測用的 附加光電 倍增管 PMT 穿透光影像感測 PMT ( Phase contrast, DIC ) 螢光感測用 PMT ( 依組配有 1 – 4 個 Channel ) K-Scanner Z- 軸掃描 分光鏡 掃描器冷卻裝置 鏡頭瞳孔照明 之光徑調控鏡 分光菱鏡 UV 光針孔鏡 Pinhole lens

開機流程 : Step 1 開機注意事項 : 確定電源為 AC220 V. 確定冷氣空調開啟. UV 雷射電源 可見光雷射 系統電源

開機流程 : Step 2 打開顯微鏡燈源 1. 螢光用汞燈 2. 穿透光用鹵素燈 打開顯微鏡燈源 1. 螢光用汞燈 2. 穿透光用鹵素燈 1. 按下汞燈開關 置於桌下 / Hg 50 W – * 汞燈開關使用間距至少須達 30 分鐘以上 * 汞燈使用壽命一般為 100 小時, 然而, 必須視實際燈管效益而定. 更換時, 請由專人更換調整. 未經許可, 勿擅自動手. 2. 按右邊的顯微鏡總電源開關 ( 左邊為 上下 鹵素燈源的切換開關 / Halogen 12V / 100W )

開機流程 : 7. 啟動 Ar 雷射, 調整旋鈕 轉到 12 點鐘位置 Step 3 開啟共軛焦供電系統 首先按下 Scanner 鈕, 開啟掃描器 電源 Scanner_ 掃描器電源 2. 電腦電源 3.Ar 雷射電源 4.He-Ne 雷射 ( Red ) 電源 ( 鑰匙往右扳下 ) 5.He-Ne 雷射 ( Yellow ) 電源 ( 鑰匙往右扳下 ) 6. 啟動 Ar 雷射, 鑰匙 往右扳至 Start 位置, 再往左扳回 至中點位置 7 請依序 1 – 7 按序開機 1.UV Laser 351 nm/ 364nm (* UV laser 請由專人開啟 ) 2.Ar Laser 458 nm / 488 nm 3.He-Ne Laser 543 nm 4.He-Ne Laser 633 nm

檢視樣品 Step 1 : 調焦 使用電控升降載物檯, 將樣品 移至近焦距處, 用微調旋轉鈕 調焦. 使用浸漬油時, 不能有氣泡產生. Step 2 : 光路控制拉桿 推入 VIS 位置, 用眼晶觀察樣 品 Step 3 : 選用適當的螢光濾鏡 “ 2 ” = I2 ( FITC ) “ 3 “ = N2.( Rodamine ) Step 4 : 將 Tube lens 轉到 UV-Scan 的位置 Step 5 : 聚焦後, 將汞燈柵門關掉, 避免汞燈過度曝晒樣品, 造成螢光漂白

啟動軟體 啟動軟體 ( 以滑鼠點選, 按二下 ) 電腦會自動起始化 掃描過程中, 請勿觸碰顯微鏡 及 防震桌 ! 電腦啟動後, 螢幕會顯示告知, 按下 [ Ctrl _ Alt _ Del ] 然後, 不用輸入 Password, 即進入 Windows NT 系統 如果有設密碼 : User : [administrator] / Password : [admin]

Start dialog 選取 由於系統啟動後, 掃描器會自動校準, 顯微鏡的 Z- 掃描台會自動歸零, 而焦距有所位移. 所以, 有時, 必須再看一下顯微鏡下的樣品, 是否有在聚焦位置 ?

A. 顯微鏡觀察及調焦 B. 選用螢光感測光譜設定 … [ Acquire ] … [ Beam ] C. 設定基本掃描參數.. [ Obj ].. [ Mode ].. [ Format ].. [ Speed ] D. 設定 Panel Box 的調控參數 與 配置位置 E. 依序執行影像擷取功能 Continuous scan ( 連續掃描 _ 取得最佳調控 ) Single scan ( 單一 2D 影像擷取 ) Series scan ( 連續斷層 3D 影像擷取 ) F. 儲存結果 與 進階影像處理, 量測, 編輯, 輸出列印.

啟動軟體之前的注意事項 : 4. 往外拉至 TCS 5. 轉至 “ 4 ” Scanner 的位置 6. 轉至 UV-Scanner 位置 ( 如有 UV-laser 裝置 ) 3. 開啟雷射電源, Ar 雷射調整旋鈕 轉到 12 點鐘位置 * UV laser 請由專人開啟 如果已完成一般顯微鏡的鏡檢及聚焦, 請依序執下列操作 : 1. 先開 Scanner 2. 再開 PC

注意 : 請留意每一個小 [ 圖示區 ] 的位置, 因為底下的控制版面是 可更改設定與移動的. 所以, 使用人員必須先行清楚每一 圖示區的放置位置. ( 未經允許, 請勿擅自更改圖示區的配置 ) 圖示區 : Control Button ( 可編輯, 可認意組配安置 ….. 您現在使用中的圖示區安排可能與本圖示配置不同 )

Control Panel 的位置與參數設定 Control Panel 有 7 個對應位置, 針對每一個 對應位置, 設定所要使用的控置參數 以滑鼠按一下, 即可得到參數選單. Z-focus PMT Gain 1/2/3/4 Pinhole Zoom 檔案管理 ( 存取 )

選取 [ Acquire ].. [ Beam ] 選取應用設定 設定光路及螢光感測光譜範圍 L : 代表原廠設定 無法變更設定 U : 代表使用者設定 可變更設定 如果要自行設定條件及一個專屬應用檔名 則, 僅按 SAVE 後, 輸入檔明即可.

參數設定 選取 Glow ( O ) Active 表示選用螢光 感測 PMT Active 光譜範圍調整 可自行調整光譜範圍 或 選用 PMT. Glow, Glow (Over) 訊號感測超過閥值, 會警示與變藍色 Glow (Under), Glow (Over & Under) 如果應用為 綠色 及 紅色 兩種顯色 雷射激發波長 螢光釋放波長 穿透光影像 感測用 PMT 可見光雷射調控 ( AOTF ) 選用雷射波長 調整雷射強度 光路徑 分光鏡

2. 選取所使用中的物鏡 如 PL-APO 63x / 1.32 Oil 1. 選取 XYZ 掃描模式 7. 選取 8 bits 選取 單向掃描 ( Unidirection ) 如果按下滑鼠, 則為雙向掃描 4. 選取 400 Medium 6. Zoom 選取 1 3. 選 512 x 512 基本掃描參數設定 5. 選 Airy 1 完成上列基本設定後, 即可開始執行連續掃描 ( Continuous scan ) 在完成 [ Acquire ] – [ Beam ] 設定後 :

連續掃描 ( Continuous scan ) 快速調整 PMT 感測 的 gain, 以藍色顯示 出現一點點為最佳狀態 調整聚焦, 讓影像清析 此位置應設為 “ Z “ 軸調控. 小小技巧 : 除了 PMT 及 Z-focus 調整外, 也可調整雷射強度, 光譜感測範圍, 或 Pinhole 大小, 或改變 PMT 的 Offset. 如果, 在經過上列的基本調整後, 已可取得不錯的影像, 則可再按一下 [ Continuous ] scan, 即可取得影像, 供儲存. 如果, 影像仍然有雜訊或不夠銳比, 則可考慮再使用平均 ( average ) 的擷取處理. Averaging 1 – 64 範圍, 可供選取使用, 供影像擷取的平均化, 以消除雜訊 ( 但, 易光漂白的染劑不適用此法 ) 移動掃描中的影像 存取個人 Panel-Box 設定

影像調控 顯示視窗 調控參數即時顯示 如果是取得 series 影像, 可利用此鈕, 播放連續動態影像 按一下滑鼠右鍵, 可更改顯示顏色 1 ch 1 ch 2 ch 3 ch 4 如果應用為 3-ch. ( FITC / TRITC / Cy5) 則第 4 個 ch. 顯示區 為 3-ch Overlay 所用 Overlay 此為 Index color 即是, 依照所選定 的顏色來作套色

Mode 功能解說 xyz An image stack is recorded from xy-sections in z-direction. ( 最為常用的掃描模式 ) xzyAn image stack is recorded from xz-sections in y-direction. xtA line is recorded several successive times. xyt An xy-section is recorded several successive times. xztAn xz-section is recorded several successive times. xyztAn image stack is recorded from xy-sections in z-direction several successive times. xy An xy-section is recorded at different wavelengths. ( 波長掃描 ) xz An xz-section is recorded at different wavelengths. Mode : 影像擷取掃描模式

Single Scan / 單一影像擷取 選取 ( 可配合 Line average 或 Averaging _ Frame by Frame )

3D series / 連續斷層影像擷取 3D series / 連續斷層影像擷取 1. 連續掃描時, 調 Z- 焦距, 找出最上點, 在 Begin 按一下, 2. 再找出最下點, 然後在 End 按一下. 3. 最後又於 連續掃描框內 ( continuous ) 按一下. 4. 再選切片數目, 平均數目, 按 Series 光切掃描. 可配合 Averaging 以消除雜訊 每一切片的影像要 做平均處理嗎 ? 決定光切數目

The Image Tool Window Tool selection Operation Buttons Dialog of the current Tool Preview

Rotation Preview 快速預覽 Animation Rotation Scaling the z-Axis Projection & Animation 設定參考 [ 3D ].. [ ImageTool ]

The Operation Buttons Usage (IV) Prev: Compute the result and show it in the Preview Window Apply: Compute the result and transfer it into the Experiment Close: Close the Image Tool Window

Projection & Animation Projection & Animation Tool Source Parameter division Current parameter

Maximum projectionAverage projection Transparent projectionTransparent projection (inverted z-Direction) Projection & Animation

x-Axis y-Axis z-Axis Original z-Rot. = 25  y-Rot. = 120  x-Rot. = 120  Rotation Projection & Animation

Stereo View

Projection & Animation Stereo Effect Near Object Far ObjectStereo Eye Angle

Projection & Animation Stereo Effect Images for the left and the right eye Stereo Image

玻片 : 0.17 mm 浸漬油 : r = Beam : L : FITC 2.Laser : AOTF 調控約至 70% 處 3.Objective : PL-APO 63x/1.32 Oil 4.Mode : XYZ 5.Format : 512 x Speed : 400 ( medium ) 7.Scan : Unidriection ( 不用按滑鼠 ) 8.Zoom : 1 ( 原廠起始設定 ) 9.Pinhole : Airy 1 ( 原廠起始設定 ) 10.Average : 8 ( 原廠起始設定 ) 11.PMT 1 gain : 約為 700 左右 12. 顯示 : Glow ( O ) 13.Overlay 顯示 : RGB 14.Continuous scan : 取得所欲觀察的聚焦面 15. 再按一次 Continuous : 停止掃描 16. 如果影像品質及解析可被接受, 請存此影像檔. 17. 如果訊號太弱, 或有雜訊, 請執行 Average ( 如取 12 張影像作為平均取像 ) 18. 執行 Single ( scan ) 即可取得單一影像. 範例 : 單一螢光影像擷取 ( FITC )

玻片 : 0.17 mm 浸漬油 : r = Beam : L : FITC / TRITC 2.Laser : AOTF 調控約至 70% 處 3.Objective : PL-APO 63x/1.32 Oil 4.Mode : XYZ 5.Format : 512 x Speed : 400 ( medium ) 7.Scan : Unidriection ( 不用按滑鼠 ) 8.Zoom : 1 ( 原廠起始設定 ) 9.Pinhole : Airy 1 ( 原廠起始設定 ) 10.Average : 8 ( 原廠起始設定 ) 11.PMT 1 / 2 gain : 約為 700 左右 12. 顯示 : Glow ( O ) 13.Overlay 顯示 : RGB 14.Continuous scan 15. 再按一次 Continuous : 停止掃描 16. 如果影像品質及解析可被接受, 請存此影像檔 ( save as..) 17. 如果訊號太弱, 或有雜訊, 請執行 Average ( 如取 12 張影 像作為平均取像 ) 18. 執行 Single ( scan ) 即可取得單一影像. 範例 : 雙重螢光影像擷取 ( FITC / TRITC) FITC TRITC

Timelapse ( T ) / 長時間掃描記錄 在 Mode 選用有 “ T “ 功能的掃描模式才可執行此功能

Time-Series 1/4 Line-Mode „xt“ Frame-Mode „xyt“ Stack-Mode „xyzt“

Time-Series 2/4 Line-Mode „xt“ Configuration

Time-Series 3/4 Stack-Mode „xyt“ Configuration

Time-Series 4/4 Stack-Mode „xyzt“ Configuration

關機流程 : 首先按下 Scanner 鈕, 開啟掃描器 電源 請依序 1 – 7 按序關機 1. 關掉 Ar 雷射, 往左調整 旋鈕轉到原點最小處. 6. 結束軟體 注意 : 當雷射冷卻至少 15 分鐘後 再關掉 [ 8 ] 位置的電源 ( 風扇 ) 關掉顯微鏡燈源 ( 汞燈, 鹵素燈 ), 擦鏡頭, 關掉實驗室總開關