תרגיל 1 פרופ' אלכס לויצקי

בקרה אנזימטית  אינטראקציות אלוסטריות  מודיפיקציות קובלנטיות הפיכות  אקטיבציה על ידי פרוטאוליזה

CTP Allosteric inhibitor ATP Aspartate trans carbamylase (ATCase) Allosteric activator

הגדרות: אפקטור אלוסטרי: ליגנד שאינו הסובסטרט, המשנה את אפיניות האנזים לסובסטרט. מאקטב אלוסטרי (אפקטור אלוסטרי חיובי): מגדיל את האפיניות לסובסטרט. מעכב אלוסטרי (אפקטור אלוסטרי שלילי): מקטין את האפיניות לסובסטרט. קואופרטיביות: קישור ליגנד (סובסטרט) אחד משפיע על אפיניות הקישור של הליגנד לסובסטרט השני

קואופרטיביות חיובית: קישור ליגנד אחד מגדיל את אפיניות הקישור של הליגנד השני. קואופרטיביות שלילית: קישור ליגנד אחד מקטין את אפיניות הקישור של הליגנד השני.

Hemoglobin טטראמר – 2 יחידות α ו – 2 יחידות β. 4 שרשראות מוחזקות על ידי קשרים לא קוולנטיים. כל יחידה מכילה קבוצת HEME (קבוצה פרוסטטית) ובה אתר קישור לחמצן. בנוסף לקישור החמצן להמוגלובין יכולת קישור של CO 2 ו – H +. קישורו של חמצן הינו קישור קואופרטיבי.

Michaelis-Menten model of protein kinetics. [E] + [S] ↔ [ES] →[E] + [P] V 0 = V max [S] K m + [S] K m = (k 2 +k -1 )/k 1 – Michaelis constant. K1K1 K -1 K2K2

hemoglobin myoglobin Y [S] Y – דרגת ריוויון תיאור Y כפונקציה של [S] בחלבון בעל אתר קישור אחד:

Hill המוגלובין מצוי בשני מצבים בלבד – קשור לחמצן או לא קשור לחמצן. אין מצבי ביניים, כלומר הקואופרטיביות היא מקסימלית. ז"א מתקיים:

חלוקת המונה והמכנה בריכוז האנזים Et והעברת אגפים: משוואת Hill

The Hill plot nHnH להמוגלובין n H =2.8 הקו ליניארי באחוזי סטורציה 10-90% בריכוזים גבוהים מאוד n=1 מספר האתרים קושרי הליגנד: n H = N

כיצד ייתכן שישנו מספר לא שלם של אתרים? Hill הניח שההמוגלובין נמצא בצורת אגרגטים, וכי ה n הוא ממוצע כל הצורות. Adair מדד את המשקל המולקולרי של המוגלובין ומצא כי מדובר בטטרהמר שאינו מתפרק בהעדר חמצן, כלומר אוכלוסית המולקולות הינה הומוגנית. לכן, לא ניתן להסביר n לא שלם ע"י קיום אגרגטים של המוגלובין, חייבים להיות מצבי ביניים של קישור. Adair מניח חלבון בעל N אתרים קושרי ליגנד ששוכנים על תת יחידות שונות זו מזו אך דומות בתכונותיהן. לכל אתר קבוע קישור משלו לליגנד (קבוע אינטרינסי). כך ניתן להבדיל בין סוגי קואופרטיביות (איך?)

תיאור מקדם Hill באמצעות קבועי הקישור של Adair: כאשר דרגת הסטורציה היא 50%: לכן, כאשר: 1.אין קואופרטיבות k’1=k’2 nH=1 2.קואופרטיבות חיובית k’1 1 3.קואופרטיבות שלילית k’1>k’2 nH<1

משמעות של מקדם Hill (n) n הוא מדד למידת הקואופרטיביות. כש n=1, אין קואופרטיביות (התנהגות מיכאלינית). n >1 פירושה קואופרטיביות חיובית. n מצביע על מספר מינימלי של אתרי קישור לסובטרט (יש לעגל את השבר כלפי מעלה). במצב תיאורטי של מקסימום קואופרטיביות, n=מספר אתרי הקישור. במקרה כזה, קישור הלינגד הראשון הוא קשה, אך משרה קישור מיידי של הליגנדים האחרים. לכן, אם בהמוגלובין n=2.8 משמע שהקואופרטיביות אינה מקסימלית (אחרת n=4).

המנגנון המולקולרי של תופעת הקואופרטיביות הוסבר על ידי שני מודלים: Concerted: מניח סימטריה – תת היחידות משתנות סימולטנית, בין אם הן מאוכלסות או לא. האנזים מצוי בצורה T (tensed) או בצורה R (relaxed). 2 הצורות מצויות בשו"מ בהעדר ליגנד. הליגנד יכול להקשר ל R או ל T. L– קבוע האלוסטריה. מה יעשה מעכב/מאקטב אלוסטרי ל L?

אבל..סטורציה הינו תהליך מדורג!

:The sequencial model החלבון נמצא בקונפורמציה אחת בהעדר ליגנד. הליגנד גורם לשינוי קונפורמציה בתת היחידה אליה הוא נקשר, השינוי יכול לעבור לתת היחידות האחרות. השינוי בקונפורמציה יכול להוריד או להעלות את האפיניות לליגנד, תלוי באפקטור. לכן, המודל יכול להסביר גם קואופרטיביות שלילית.

דוגמה לחלבונים עם בקרה אלוסטרית ACh Receptor – 2 sites Aspartate-transcarbamoylase – 6 sites Hemoglobin – 4 sites

Michaelis-Menten curve and its linearization(Lineweaver-Burk plot). Km – הינו ריכוז הסובסטרט בו מהירות הריאקציה מגיעה למחצית מהמהירות המקסימלית.

Competitive and Non- competitive Inhibition. Km changes But enough substrate will overcome inhibitor!! Vmax changes

קינטיקה של עיכוב... CompetitiveNon-Competitive (Binds both E and ES) V max – constant K m - increases V max – decreases K m - constant V max KmKm  An un-competitive inhibitor binds only the ES complex, and both Vmax and Km change.

האפקטור האלוסטרי לעולם לא ייקשר לאתר הפעיל (אתר קושר הסובסטרט). קיימים שני סוגים של אפקטורים אלוסטרים: כאלה שמשפיעים על אפיניות הסובסטרט לאנזים (K systems), לדוגמא, המצב באספרטט טרנסקרבמילאז. באפקטורים מסוג זה, גרף L.B. ייראה כעיכוב תחרותי נורמלי. כאלה שמשפיעים על Kcat (ולכן על Vmax). ( - (V systems

Pyrimidine nucleotide Synthesis pathway ביוסינתזה של פירימידינים מבוקרת בעזרת Feedback Inhibition על פעילות Aspartate transcarbamoylase ATP – Positive regulator CTP – Negative regulator

Aspartate transcarbomoylase (ATCase) החלבון מורכב מ – 12 תתי יחידות. 6 יחידות רגולטוריות ו – 6 יחידות קטליטיות. ישנם 6 אתרים בעלי בקרה אלוסטרית. קישור הסובסטרטים הינו קואופרטיבי.

קינטיקה של הבקרה ATP ו CTP נקשרים לאותו אתר אלוסטרי בתת-היחידות הרגולטוריות. ATP נקשר באפיניות גבוהה יותר לצורון הפעיל (R) ו-CTP לצורון הסגור (T). קישור ATP לצורון הלא פעיל מוביל לשינוי קונפורמציה ומעבר ל-R.

NO CTP L=200 L=1250

+ 10 mM ATP ATP is an allosteric activator NO CTP L=200 L=70

משמעות הביולוגית של הבקרה. רמה גבוהה של ATP מצביעה על מצב בו יש מספיק אנרגיה לייצור חומצות גרעין. שמירה על יחס פורינים = פירימידינים. עיכוב של ATCase על ידי CTP מבטיח שלא ייווצרו פירימידינים נוספים ללא צורך בכך ובכך למעשה חוסך לתא בזבוז אנרגטי. CTP מתחרה על ATP על אותו אתר ביחידה רגולטורית.