Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים של DNA כל עוד ידועים רצפים המקיפים אותו. התוצאות מתקבלות תוך מספר שעות בלבד בהתחלה בוצע ידנית. כיום - יש מכשירים המבצעים את הריאקציה. 1993: פרס נובל לכימיה

מרכיבי ריאקציית ה -PCR: נוקליאוטידים (dNTP ’ s)- A T G C נוקליאוטידים (dNTP ’ s)- A T G C תחלים ( פריימרים ) תחלים ( פריימרים ) בופר המכיל יוני Mg +2 בופר המכיל יוני Mg +2 אנזים Taq Polymerase אנזים Taq Polymerase תבנית (Template) תבנית (Template)

Hot water bacteria: Thermus aquaticus Taq DNA polymerase Life at High Temperatures by Thomas D. Brock Biotechnology in Yellowstone © 1994 Yellowstone Association for Natural Science

Melting 94 o C Temperature T i m e 5’3’ 5’

Melting 94 o C Temperature T i m e 3’5’ 3’ Heat

Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperature T i m e 3’5’ 3’ 5’ Melting 94 o C

Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperature T i m e 30x 3’5’ 3’ Heat 5’

Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperature T i m e 30x 3’5’ 3’ 5’

Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperature T i m e 30x 3’5’ 3’ 5’ Heat

Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperature T i m e 30x 3’5’ 3’ 5’

Fragments of defined length Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperature T i m e 30x 3’5’ 3’ 5’

מחזור ה -PCR: Step 17 min at 94˚CInitial Denature Step 245 cycles of: 20 sec at 94˚CDenature 20 sec at 52˚CAnneal 1 min at 72˚CExtension Step 37 min at 72˚CFinal Extension Step 4Infinite hold at 4˚CStorage Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C X30

DNA Between The Primers Doubles With Each Thermal Cycle 0 Cycles Number

More Cycles = More DNA Number of cycles Size Marker

Theoretical Yield Of PCR Theoretical yield = 2 n x y Where y = the starting number of copies and n = the number of thermal cycles = 107,374,182,400 If you start with 100 copies, how many copies are made in 30 cycles? 2 n x y = 2 30 x 100 = 1,073,741,824 x 100

שימוש ב -PCR: קריאת רצף התוצרים קריאת רצף התוצרים זיהוי מחלות גנטיות זיהוי מחלות גנטיות איבחון איפקציות ויראליות / חיידקיות איבחון איפקציות ויראליות / חיידקיות קביעת מין העובר קביעת מין העובר מוטגנזה מכוונת מוטגנזה מכוונת

ריצוף דנ " א קביעת רצף הנוקליאוטידים של מקטע דנ " א מסויים השיטה המקובלת כיום - פותחה ע " י פרדריק סנגר בשנות ה : Walter Gilbert (Biol. Labs) & Frederick Sanger (MRC Labs)

Dideoxy DNA sequencing-How it works: מעמידים ארבע ריאקציות שונות. בכל ריאקציה : DNA template Primer annealed to template DNA רק פריימר אחד !!! : DNA polymerase dNTPS (dATP, dTTP, dCTP, and dGTP) אך בריאקציית הריצוף - מוסיפים גם ddNTP: ddATP/ ddTTP/ ddCTP/ ddGTP הנוקליאוטידים הללו מסומנים ריכוזם - 1/100 מריכוז שאר הנוקליאוטידים. למה ddNTP? במקום 3’-OH יש לו 3’-H – לא יכול להיווצר קשר פוספודיאסטרי - וההלונגציה של השרשרת לא יכולה להמשיך.

מהלך הריאקציה : זהה לריאקציית PCR דנטורציה של מקטע ה -DNA אותו אנו מרצפים דנטורציה של מקטע ה -DNA אותו אנו מרצפים Annealing של הפריימר ל -Template Annealing של הפריימר ל -Template Extention- הארכת השרשרת היא לכיוון אחד בלבד בגלל ששמנו רק פריימר אחד Extention- הארכת השרשרת היא לכיוון אחד בלבד בגלל ששמנו רק פריימר אחד מתי ההארכה מסתיימת ??? מתי ההארכה מסתיימת ??? - כאשר מעלים את הטמפרטורה ל - 94 מעלות - כאשר מעלים את הטמפרטורה ל - 94 מעלות - כאשר נכנס נוקליאוטיד ddNTP - כאשר נכנס נוקליאוטיד ddNTP אנליזה של התוצאות : הרצה על ג ' ל מיוחד ( אקרילאמיד )

מה מתקבל בריאקציה ? העמדנו 4 ריאקציות - בכל אחת ddNTP מסומן אחר מתקבלים תוצרים באורכים שונים - המסתיימים במקומות שבהם ישנו נוקליאוטיד מסומן

תוצרים ארוכים תוצרים קצרים Radio-labeled ddNTPs (4 rxns) קריאת הרצף (5’ to 3’) G A T A T A C T G T

כיום - הריצוף אוטומטי ומשתמש בסימון פלורסנטי במקום רדיואקטיבי ריצוף רדיואקטיבי : דורש הרבה זמן ושימוש בחומר רדיואקטיבי היום הוחלף בשימוש בסימון פלורסנטי - כל נוקליאטיד מסומן בצבע אחר. ארבעת הריאקציות אוחדו לריאקצייה אחת. ההרצה - בג ' ל קפילרי מיוחד כל נוקליאוטיד מסומן - נותן פיק של צבע שנקרא ע " י המכשיר