1 分子生物学技术

2 第一节、重组 DNA 技术 - 基因工程 第二节、分子杂交及相关技术第三节、聚合酶链反应的原理和应用第四节、基因定位的常用方法

3 分子生物学技术 70 年代以来, 分子生物学技术迅速发展起 来, 使人们有可能进行人类基因组及单个 基因的结构研究, 分析其功能特征, 了解其 变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗 传病的本质起着重要作用。下面就一些分 子生物学技术予以介绍。 70 年代以来, 分子生物学技术迅速发展起 来, 使人们有可能进行人类基因组及单个 基因的结构研究, 分析其功能特征, 了解其 变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗 传病的本质起着重要作用。下面就一些分 子生物学技术予以介绍。

DNA 是遗传物质 1949Hbs 贫血 1953 双螺旋 1956HbsGlu-Val 1966 遗传密码 第一个 R 酶 1972 重组质粒 1975DNA 杂交 1977DNA 测序 1981 转 G 小鼠 1983HD 病 G 定位 1985PCR 1986 位置克隆 1987G 剔除小鼠 1989 位置克隆 1990 第一个基因治疗 1995 细菌 G 组序列 1996 酵母基因组序列 现代分子遗传学发展 重要事件

5 第一节 重组 DNA 技术 - 基因工程 第一节 重组 DNA 技术 - 基因工程 重组 DNA 技术是现代分子生物技术发展中最 重要的成就之一。即是基因工程 (Gene Engineering) 的核心技术。 重组 DNA 技术是现代分子生物技术发展中最 重要的成就之一。即是基因工程 (Gene Engineering) 的核心技术。 重组 DNA 技术（ Recombinant DNA Technique ）是人类根据需要选择目的基因 （ DNA 片段）在体外与基因运载体重组，转 移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创 造新的物种和治疗人类疾病的目的。 重组 DNA 技术（ Recombinant DNA Technique ）是人类根据需要选择目的基因 （ DNA 片段）在体外与基因运载体重组，转 移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创 造新的物种和治疗人类疾病的目的。 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的 发现和应用。 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的 发现和应用。

6 一、限制酶 一、限制酶 限制性内切核酸酶 (restrictive endonucleases) ，又称限制酶。是特异性地 切断 DNA 链中磷酸二酯键的核酸酶（ “ 分子手 术刀 ” ）。 限制性内切核酸酶 (restrictive endonucleases) ，又称限制酶。是特异性地 切断 DNA 链中磷酸二酯键的核酸酶（ “ 分子手 术刀 ” ）。 发现于原核生物体内，现已分离出 100 多种， 几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组 DNA 技术和基因诊断中重要的一类工具酶。 发现于原核生物体内，现已分离出 100 多种， 几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组 DNA 技术和基因诊断中重要的一类工具酶。

7 1 、限制酶的命名 根据其来源命名。如： 根据其来源命名。如： 属名 菌株名 属名 菌株名 E co R I E co R I 种名 编号 种名 编号 EcoRI 来源于大肠杆菌 E.coli 的 RY13 菌株,I 指在该菌株中分离的第一个限制酶。 EcoRI 来源于大肠杆菌 E.coli 的 RY13 菌株,I 指在该菌株中分离的第一个限制酶。

8 2 、限制酶识别序列和切割形成 每种限制酶能识别和切割的通常 4 ～ 8 个核苷酸序 列，称为限制性位点或切点。 每种限制酶能识别和切割的通常 4 ～ 8 个核苷酸序 列，称为限制性位点或切点。 如： Hare Ⅲ 5’-GGCC-3’ 如： Hare Ⅲ 5’-GGCC-3’ Bam HI 5’-GGATCC-3` Bam HI 5’-GGATCC-3` 平末端 (blunt end) 对称轴切，连接效果差 平末端 (blunt end) 对称轴切，连接效果差 切割形成 粘性末端（ sticky end ）交错切。 切割形成 粘性末端（ sticky end ）交错切。

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10 部分常用限制酶及切点部分常用限制酶及切点部分常用限制酶及切点部分常用限制酶及切点

11 互补末端连接

12 产生相同序列的突出末端的不同片段 可有三种方式： 1) 用同一种限制酶切割； 1) 用同一种限制酶切割； 2) 用识别相同靶序列的不同限制酶切割； 2) 用识别相同靶序列的不同限制酶切割； 3) 用识别不同靶序列但可产生一致的粘 性末端的限制酶切割。 3) 用识别不同靶序列但可产生一致的粘 性末端的限制酶切割。

13 3 、特点： 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断 中的重要用途： 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断 中的重要用途： 1) 不论 DNA 的来源如何，同一种限制酶切割后产 生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属 的 DNA 重组。如人和质粒 DNA 等。 1) 不论 DNA 的来源如何，同一种限制酶切割后产 生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属 的 DNA 重组。如人和质粒 DNA 等。 2) 用于人类基因组的 DNA 分析，具特定的酶切位 点。 2) 用于人类基因组的 DNA 分析，具特定的酶切位 点。 3) Gene 突变改变酶切位点的消失或新产生将改变 酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。 3) Gene 突变改变酶切位点的消失或新产生将改变 酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。

14 二、基因运载体及其选择 载体（ Vector ） : 将外源目的 DNA 导入受体细 胞，并能自我复制和增殖的工具。 载体（ Vector ） : 将外源目的 DNA 导入受体细 胞，并能自我复制和增殖的工具。

15 载体具以下特征： 载体具以下特征： 1) 分子量小，便于携带较大的 DNA 片段，能 进入宿主细胞并在其中增殖； 1) 分子量小，便于携带较大的 DNA 片段，能 进入宿主细胞并在其中增殖； 2) 有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有 单一切点； 2) 有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有 单一切点； 3) 被切割后的载体，插入外源 DNA 后，不影 响其复制能力，并有可选择的标记基因（如， 抗药基因）。 3) 被切割后的载体，插入外源 DNA 后，不影 响其复制能力，并有可选择的标记基因（如， 抗药基因）。 常用的载体有：质粒， λ 噬菌体，粘粒， BAC ， YAC ， PI 等。 常用的载体有：质粒， λ 噬菌体，粘粒， BAC ， YAC ， PI 等。

16 （一）. 质粒 plasmid Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环 DNA 分子。 Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环 DNA 分子。 PBR322 PBR322 大肠杆菌 pSC101 大肠杆菌 pSC101 Plasmid chromosome COIEI Plasmid chromosome COIEI plasmid 革兰氏阴性菌 pc194 plasmid 革兰氏阴性菌 pc194 scp12 scp12 真核生物 - 酵母质粒 真核生物 - 酵母质粒

17 常用的质粒如 pUC19 ，多连接子 MCS 。插入外源基因片段 长度约 10kb 。将外源基因插入到 MCS 中，随质粒的表达而 表达，增殖而扩增。外源基因插入到 MCS 后， β- 半乳糖苷酶 的活性丧失而不显兰色 - 白色菌落。如果不插入外源基因， 则产生兰色。从而筛选阳性菌落。 EcoRIHindIII Ori 复制起 点 LacZ AP R pUC19

18 （二）.λ- 噬菌体 (λphage) （二）.λ- 噬菌体 (λphage) 是一种可在体外包装的细菌病毒, 可高效感染 大肠杆菌.λ- 噬菌体 DNA 是线状双链 DNA 分子, 全长约 50kb, 每条链各带 12bp 长的单链互补末 端 - 粘末端 (COS 序列 ) 。进入宿主细胞后不久， COS 序列碱基配对环化。 是一种可在体外包装的细菌病毒, 可高效感染 大肠杆菌.λ- 噬菌体 DNA 是线状双链 DNA 分子, 全长约 50kb, 每条链各带 12bp 长的单链互补末 端 - 粘末端 (COS 序列 ) 。进入宿主细胞后不久， COS 序列碱基配对环化。 改建后的 λ 噬菌体发展了多种较大型的克隆载 体，如： 改建后的 λ 噬菌体发展了多种较大型的克隆载 体，如：

19 1 、置换 λ 载体 – 溶解途径 1 、置换 λ 载体 – 溶解途径 载体和外源 DNA 整合到宿主菌 DNA 中。 可克隆 23kb 的外源 DNA 。 载体和外源 DNA 整合到宿主菌 DNA 中。 可克隆 23kb 的外源 DNA 。 2 、插入 λ 载体 – 裂解途径 2 、插入 λ 载体 – 裂解途径 DNA 在宿主细胞中复制，然后包装成 噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可 克隆 5kb 的 cDNA 。 DNA 在宿主细胞中复制，然后包装成 噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可 克隆 5kb 的 cDNA 。

20 裂解途径裂解途径裂解途径裂解途径

21 （ 三）. 粘粒 (cosmid vector) （ 30 ～ 40kb ） 是将质粒和 λ 噬菌体改建的一种载体. 它含 COS 序列, 插入一小 plasmid – 而得名 Cosmid 。改建后的粘粒含有 λ 噬菌体的复 制起点和 cos 末端。全长 8kb 。大片段外 源 DNA 插入后，在体外包装进而被克隆。 可包装 30 ～ 45kb 长的 DNA 片段，多用于 基因文库构建。

22 ( 四 ) 大片段 DNA 克隆载体 人类和哺乳动物的基因组很大，甚 至许多单个基因也相当大（如： DMD gene 2300kb ） ，克隆分析就 需要更大的基因载体。如近年来构 建的一些载体： BAC ， PI ， YAC 等。 人类和哺乳动物的基因组很大，甚 至许多单个基因也相当大（如： DMD gene 2300kb ） ，克隆分析就 需要更大的基因载体。如近年来构 建的一些载体： BAC ， PI ， YAC 等。

23 1 、细菌人工染色体（ bacterial artificial chromosome,BAC ） 优点：能携带大片段 DNA ， 约 300kb 。 优点：能携带大片段 DNA ， 约 300kb 。 在每个细胞中，一个载体 分子能繁殖多个拷贝，高 产 DNA 。 在每个细胞中，一个载体 分子能繁殖多个拷贝，高 产 DNA 。 缺点：会出现插入片段在 结构上的不稳定，导致克 隆 DNA 部分的缺失或重排。 为克服上述缺点，人们采 用低拷贝数复制子载体， 如， E coli 中的 F 因子。此 质粒含有 2 种基因（ part A, part B ）。每个 E coli 能接 受 >300kbDNA 片段。 缺点：会出现插入片段在 结构上的不稳定，导致克 隆 DNA 部分的缺失或重排。 为克服上述缺点，人们采 用低拷贝数复制子载体， 如， E coli 中的 F 因子。此 质粒含有 2 种基因（ part A, part B ）。每个 E coli 能接 受 >300kbDNA 片段。

24 2 、噬菌体 PI 载体和 PAC PI 噬菌体与 λ 噬菌体一样，外有蛋白质壳。 内含相当大的（ 110 ～ 115kb ）线性 DNA ，并在体外包装于 PI 壳内。 PI 进入 宿主细胞后环化，扩增。 PI 噬菌体与 λ 噬菌体一样，外有蛋白质壳。 内含相当大的（ 110 ～ 115kb ）线性 DNA ，并在体外包装于 PI 壳内。 PI 进入 宿主细胞后环化，扩增。 1994 年，有人将 PI 和 F 因子克隆结合产 生 PI 人工染色体克隆系统 -----PAC 。 1994 年，有人将 PI 和 F 因子克隆结合产 生 PI 人工染色体克隆系统 -----PAC 。

25 3 、酵母人工染色体（ yeast artificial chromosome, YAC ） 适用 于克 隆大 片段 DNA ， 0.2 ～ 2Mb 。 适用 于克 隆大 片段 DNA ， 0.2 ～ 2Mb 。

26 YAC 的主要功能成份有三： 1 ）着丝粒： mitosis 姊妹染色单体和减 I 同源 染色体分离之必需。 1 ）着丝粒： mitosis 姊妹染色单体和减 I 同源 染色体分离之必需。 2 ）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵 袭。 2 ）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵 袭。 3 ）自主复制序列（ ARS ）元件：是染色体 自主复制的复制起点。 3 ）自主复制序列（ ARS ）元件：是染色体 自主复制的复制起点。 构建 YAC 需要 4 个短序列： 2 个端粒，着丝粒， ARS 元件，与外源 DNA 连接成线性 DNA 分子， 导入酵母细胞克隆。 构建 YAC 需要 4 个短序列： 2 个端粒，着丝粒， ARS 元件，与外源 DNA 连接成线性 DNA 分子， 导入酵母细胞克隆。

27 三、 DNA 重组与分子克隆化 为获得所需的基因或特异序列， 需从细胞中分离得到目的基因与载 体 DNA 重组，并用适当方法在宿主 细胞中表达，扩增得到大量相同的 DNA 片段，称为 DNA 克隆，亦称分 子克隆。 为获得所需的基因或特异序列， 需从细胞中分离得到目的基因与载 体 DNA 重组，并用适当方法在宿主 细胞中表达，扩增得到大量相同的 DNA 片段，称为 DNA 克隆，亦称分 子克隆。

28 基本原理与过程： 基本原理与过程： 1 、分离纯化目的基因 1 、分离纯化目的基因 2 、目的基因 + vector = 重组 DNA 分子 2 、目的基因 + vector = 重组 DNA 分子 3 、重组 DNA 分子导入受体细胞，并在其内增殖。 3 、重组 DNA 分子导入受体细胞，并在其内增殖。 4 、筛选含有重组 DNA 的细胞 —— 细胞克隆（ cell clone ），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细 胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传 相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆 移至液体培养基中进行扩增。 4 、筛选含有重组 DNA 的细胞 —— 细胞克隆（ cell clone ），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细 胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传 相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆 移至液体培养基中进行扩增。 5 、分离重组 DNA 克隆：即收获扩增的培养细胞， 并选择分离重组 DNA 。 5 、分离重组 DNA 克隆：即收获扩增的培养细胞， 并选择分离重组 DNA 。

29 分离纯化目的基因 目的基因 + vector = 重组 DNA 分子

30 重组 DNA 和 分子 克隆

31 重组 DNA 和分子克隆的几种方法： （依目的基因的来源） 1 、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆 1 、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆 2 、由特定 mRNA 逆转录合成 cDNA 后再进行 2 、由特定 mRNA 逆转录合成 cDNA 后再进行 克隆 克隆 3 、化学合成目的基因进行克隆 3 、化学合成目的基因进行克隆 4 、 PCR 体外扩增目的片段进行克隆 4 、 PCR 体外扩增目的片段进行克隆

32 从基因 组中分 离目的 基因在 细胞中 克隆

33 筛选含有重组 DNA 的细胞 —— 细胞克隆（ cell clone ）

34 筛查含有目的基因的细胞克隆

35 四、目的基因表达 上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩 增，获得足够量的目的基因来进行结构与功 能的研究。 上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩 增，获得足够量的目的基因来进行结构与功 能的研究。 重组 DNA 技术的另一目的是获得基因重组后 的产物 —— RNA ，蛋白质。 重组 DNA 技术的另一目的是获得基因重组后 的产物 —— RNA ，蛋白质。 就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主 细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。 如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异 的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。 （ expression cloning ）. 就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主 细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。 如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异 的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。 （ expression cloning ）.

36 目的基 因表达

37 （一）．真核细胞的基因在原核细胞 （细菌）中表达 原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如， RNA 剪 接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆 原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如， RNA 剪 接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆 菌为宿主。 菌为宿主。 真核多肽的表达要求： 真核多肽的表达要求： 1 ）适当的 cDNA （完整的编码序列）； 1 ）适当的 cDNA （完整的编码序列）； 2 ）适当的表达载体，提供特定多肽信息； 2 ）适当的表达载体，提供特定多肽信息； 3 ）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。 3 ）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。 产物特征： 产物特征： 1 ）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定； 1 ）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定； 2 ）活性受限或无活性。 2 ）活性受限或无活性。

38 ( 二 ) 、真核细胞基因在真核细胞中表达 真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的 环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。 真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的 环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。 应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究 特定基因的表达。 应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究 特定基因的表达。 产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋 白的稳定和功能活性。 产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋 白的稳定和功能活性。

39 五 、基因文库 五 、基因文库 基因文库（ gene library ）, 应用 DNA 重组 技术构建的含有基因组的全部基因的 DNA 克隆。 基因文库（ gene library ）, 应用 DNA 重组 技术构建的含有基因组的全部基因的 DNA 克隆。

40 （一） 构建基因 组 DNA 文 库

41 （ 二）染色体特异的基因文库 （ chromosome specific library ） 单个染色体 → 细胞克隆 单个染色体 → 细胞克隆 （流式 C 仪） ↓ （流式 C 仪） ↓ 细胞 → 染色体 染色体文库 染色体区带 → 区带特异 染色体区带 → 区带特异 （显微切割 ） ↓ （显微切割 ） ↓ DNA 文库 DNA 文库

42 （三） cDNA 文库（ cDNA library ） （三） cDNA 文库（ cDNA library ） cDNA 文 库构建： 特定组织 细胞一 定发育 阶段 总 mRNA