Screening diseases by high-throughput sequencing Presented by: Xiao Chen ChenXiao 2015.07.26 1

Introduction What is high-throughput sequencing? Application of high-throughput sequencing? 提到高通量测序技术，我们得问两个问题。 ChenXiao 2015.07.26 2

What is ? Gut 2013;62:920–932. doi:10.1136/gutjnl-2011-301935 一个连有接头的DNA片段，可以结合到一个固相表面，这个固相表面上有很多化学共价键修饰的寡聚核苷酸，可以识别DNA片段上的接头，然后进行桥式PCR，产生数百万个DNA拷贝数。 油包水的乳液反应体系，中间有一个磁珠，一个DNA模板，DNA片段通过接头与磁珠相连，在这个独立的液滴系统内进行PCR扩增反应，每个片段扩增后产生几百万个相同的拷贝。 Gut 2013;62:920–932. doi:10.1136/gutjnl-2011-301935 ChenXiao 2015.07.26 3

What is ? Sequencing of millions of fragments of DNA in parallel. Mapping fragments to the human reference genome and find variation. High-throughput sequencing Massively parallel sequencing Deep sequencing Next Generation sequencing （NGS） 所以一句话简单地概括什么是高通量测序技术，就是对数百万条DNA片段进行平行的测序。再把这些片段比对到人类参考基因组上然后寻找突变。 因此高通量测序又可以叫大规模平行测序，高通量测序或者下一代测序技术。 ChenXiao 2015.07.26 4

Solexa Genome Analyzer 454 GS FLX AB SOLiD    Solexa Genome Analyzer 454 GS FLX AB SOLiD  Comparison of Next-Generation Sequencing Systems 454:M. Droege, B. Hill / Journal of Biotechnology 136 (2008) 3–10 454(2005)-Solexa(2006)-SOLiD(2006)-Hiseq(2007)-PGM(2010) 人类基因组计划宣布完成的第二年，2005年454公司推出了焦磷酸测序的454测序仪，随后的2006年Solexa公司推出了Genome Analyzer 这款机器，采用桥式PCR技术边合成边测序，随后2007年Illumnia收购Solexa公司。同年ABI公司推出了SOLiD连接法测序仪。 这是二代测序仪器的一个发展历史：2005年由life science 公司推出了焦磷酸测序的454测序仪，开启了二代测序的时代。2006年，Solexa公司推出了Genome Analyzer 这款桥式PCR边合成边测序的机器，同年ABI 公司推出连连接法测序的SOLiD测序仪。 2007年，Illunmina公司收购Solexa公司，再原来Solexa测序仪基础上开发除了Hiseq测序仪，这标志二代测序进入一个新的事业高度，因为目前为止Illumina公司的测序仪市场占有率达到70%。此后2010年，life technology 公司推出了油包水的半导体测序仪，PGM和Proton，这两款测序仪是仅次于illlumia 测序仪的市场占有率，但是其在临床预测和诊断的应用率明显高于Hiseq测序仪。 2010年以后还相继出现了第三代测序技术，包括BioPacific 公司的实时单分子测序技术以及牛津纳米孔测序技术。这里我就不全部列出来了。 454测序仪已经被Roche公司收购，并且Roche公司宣布2016年停止所有454测序仪的业务，也标志这个测序仪的退出。  PGM Hiseq

Comparison of different NGS platforms A图是不同测序平台的最大读长比较，蓝色代表该品牌刚出现是的最大读长，红色橙色代表目前品牌最新推出测序仪的最大读长。从图上可以看到读长方面明显占优势的是PacBio公司推出的第三代测序仪，它的最大读长目前可以达到20KB，其次是Roche公司的454测序仪，而市场占有率高的Illumina和Ion Torrent的测序读长并不占优势。B图代表了各个平台的测序通量，Illumina的最大通量可以达到1800GB（1.8TB），因此也是以通量最大占据了测序主导地位。C图测序的费用，以测一个人类基因组的成本为例，在2001年，也就是人类基因组公布的第一份草图时候，当时测序一个人类基因组是1亿美金,而其实从1990年公布人类基因组计划的时候，到2005年基因组计划宣布完成，总共花费了30亿美金测序人类基因组。随后测序费用逐年下降，直到了2007年，Illumina公司收购了Solexa公司以后，推出Hiseq测序平台，测序成本急剧下降，截止到去年2014年，测量一个人类基因组只需要1000美金，而这个下降趋势仍在继续，随后几年测序成本降到100美金一个基因组。D图是不同平台测序花费的时间，以测量一个细菌基因组作图，目前测序速度最快的是Ion Torrent 公司的PGM 和Proton测序平台，只需要3小时。 Trends in Genetics September 2014, Vol. 30, No.9.

2007年是以一代测序为主，到了2007年，illumina公司收购了英国Solexa公司，推出了Hiseq测序仪，这样就开启了高通量测序的一个新的时代，之后二代测序进入了生命科学的一个新事业。这个图片是国际基因组人类研究所最新公布的一个统计结果。目前测一个人类基因组成本是1000美金（但是考虑到了人力物力，机器折旧费等最新的人类基因组测序价格为4000美金），当然科学家最新的计划是把测序成本降低到100美金每个样本。 ChenXiao 2015.07.26 7

Work flow of conventional versus second-generation sequencing Frederick Sanger Sanger、Gilbert、Maxam获得1980年诺贝尔化学奖 1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。 2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP（包括放射性标记的ddNTP，例如32P ddNTP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP（双脱氧核苷酸）。 3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理）结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。 4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP（如ddATP），则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基（如A）处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。 5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。 Maxam and Gilbert 化学降解法测序不需要酶促反应，因而不会产生由酶促反应带来的误差，对未经克隆的DNA片段可以直接测序。 一代测序主要缺点：通量低、操作步骤繁琐、速度慢不适用大规模样本测序。随着计算机技术、仪器制造和生物信息学技术发展，二代测序技术。。。。。 一代测序的主要优点是：测序读长最长，最长达到1KB。目前仍然是基因突变检查的一个金标准，通过一代测序来验证二代测序的结果。 Walter Gilbert Nature Biotechnology , 26(10):1135-1145.

2015.07.26 9 DNA isolation Library preparation Sequencing Data analysis 本课题采用的研究方法，首先是利用特异性结合DNA离心吸附柱法分离外周血DNA,再进行测序文库的构建，然后上机测序，最后完成数据分析。首先是提取患者外周血当中的基因组DNA，然后经超声随机大段成200kb的片段。如果将这些片段直接送进测序仪就是全基因组测序。而这里我们使用了Roche公司的Nimblegen技术设计了目标区域基因捕获探针，也就是前面提到的62个基因。通过杂交的方法来捕获目标区域，然后通过洗脱液洗掉未杂交的区域。剩下的就是我们要测的区域，这也是测序前期文库制备的一个流程。将制备好的文库送进测序仪，我们打算采用Illumina公司的Hiseq2000这个型号的仪器，它的核心技术是可逆终止荧光标记dNTP的边合成边测序，测序数据量高，测序核心区flowcell上的一个lane可以产生高达30G的有效数据，并且测序的质量也高，Illumina公司承诺了测序所有原始数据Q30大于80%，也就是碱基准确性为99.9%的数据占总数据的80%。最后一步就是测序的数据进行数据分析。 ChenXiao 2015.07.26 9

NGS APPLICATION ? Genetic diagnosis of common and rare diseases Cancer research Prenatal diagnosis Transcriptome studies Microbiological studies Evolutionary and population studies Forensics 。。。。。。。。 A glimpse into past, present, and future DNA sequencing ChenXiao 2015.07.26 10

NGS APPLICATION ? BRIEFINGS IN BIOINFORMATICS. VOL 11. NO 5. 484-498 ChenXiao 2015.07.26 11

Non-Invasive Prenatal Diagnosis（NIPT） 1997年，由香港大学卢玉明教授等人，首先发现怀孕母亲血浆中存在胎儿游离的DNA。cffDNA来源于胎盘滋养层细胞，通过胎盘屏障进入母体血浆，孕妇外周血中的cffDNA从怀孕第四周左右就可以检测出来，孕8周建立胎儿胎盘循环后cffDNA可以一定的比例稳定存在与母体外周血浆中。到了孕12周以后，cffDNA占母亲血浆DNA总数10%，以核小体形式稳定存在。所以cffDNA成为无创产前检查最优材料。 Cell-free fetal DNA(cffDNA) Trophoblasts cell 10% of the DNA in maternal plasma Lancet 1997;350:485-87 ChenXiao 2015.07.26 12

Work flow of NIPT 2014 May 20;111(20):7415-20. doi: 10.1073/pnas.1321997111. ChenXiao 2015.07.26 13

Z-score Liao etal.PNAS, May20,2014 .vol.111 ,no.20,7417 2015.07.26 14 具体是通过什么样的统计分析来进行染色体非整倍性计算，就是Z分数，又称为标准分数。标准分数代表了原始分数与平均数之间的距离。A图是一个13三体综合症的例子。正常核型集落处于Z分数3以下，13三体综合症的患者Z分数明显大于3。B图是18三体综合症的例子，C图是21三体综合症。D图是X染色体在男女不同性别比例总的分布情况，女性因为有两条X染色体，因此Z分数大于3，男性 Liao etal.PNAS, May20,2014 .vol.111 ,no.20,7417 ChenXiao 2015.07.26 14

False-positive rate (95% CI), % Summary of studies Full sample, n Trisomy 21 sample, n False-positive rate (95% CI), % Sensitivity (95% CI), % Specificity (95% CI), % Method References 18 9 0 (0–37) 100 (63–100) NGS Fan et al., 2008 28 14 0 (0–27) 100 (73–100) Chiu et al., 2008 47 13 0 (0–13) 100 (72–100) 100 (87–100) Sehnert et al., 2011 449 39 0.3 (0.1–1.5) 100 (89–100) 99.7 (98.5–99.9) Ehrich et al., 2011 146 86 2.1 (0.6–6.4) 100 (95–1) 97.9 (93.6–99.4) Chiu et al., 2011 1696 212 0.2 (0.1–0.7) 98.6 (95.9 –99.7) 99.8 (99.3–99.9) Palomaki et al., 2011 298 0 (0–1.8) 100 (88.8–1) 100 (98.2–100) Sparks et al., 2012 167 36 0 (0–3.6) 100 (88.0–100) 100 (96.4–100) 532 89 0 (0–1.1) 100 (94.8–100) 100 (98.9–100) Bianchi et al., 2012 ChenXiao 2015.07.26 15

一期临床试验 灵敏度 特异性 阳性预测值 阴性预测值 T21 100% (40/40) 100% (372/372) T18 100% (14/14) 100% (398/398) T13 100% (4/4) 99.75% (407/408) 80% (4/5) 100%(407/407) T9 100% (1/1) 100% (411/411) 45X 100% (5/5) 99.75% (406/407) 83.3% (5/6) 100% (406/406) XXX XXY XYY 五大染色体 复合检测 100%(67/67) 99.71% (344/345) 98.53%(67/68) 100% (344/344) 这是国内一家基因检测公司贝瑞和康2010年，与中南大学湘雅医学院合作开展的一期回顾性临床试验。试验共检测有效样本412例，检测结果显示贝比安检测的复合灵敏度为100%，复合特异性为99.7%以上。 Prenat Diagn 2013,32:1-7. ChenXiao 2015.07.26 16

二期临床试验 血清学筛查 贝比安 (+) (-) 核型分析阳性 6 5 11 核型分析阴性 243 1487 1* 1729 总计 249 核型分析阴性 243 1487 1* 1729 总计 249 1492 12 灵敏度(95% CI) 54.55%(24.56% – 81.86%) 100.00%(67.86% – 100%) 特异性(95% CI) 85.95%(84.21% – 87.54%) 99.94%(99.63% – 99.99%) FPR 14.05% 0.05% FNR 45.45% 0.00% PPV 2.41% 94.74% 这是国内的一家基因测序公司叫做贝瑞和康，与北京协和医院合作开展二期大规模前瞻性临床试验。试验共检测有效样本是1741例，实验结果显示，贝比安对T21/T18/T13三大染色体疾病的复合检测灵敏度为100%，特异性为99.94%，远高于血清学筛查、且假阳性率、假阴性率更低。 Prenat Diagn. 2013 Jul;33(7):700-6. doi: 10.1002/pd.4160. Epub 2013 Jun 17. ChenXiao 2015.07.26 17

NIPT技术优势 ChenXiao 2015.07.26 18

Thank you for your attention ChenXiao 2015.07.26 19