9 ème symposium national du réseau Inserm de Recherche sur la Douleur Bordeaux 22-23 mars 2013 From the Poplar mecano-perception to visceral sensitivity in mice: role of ubiquitous transcription factor EGR-4? Alison Accarie / 2ème année de thèse Directeur de thèse : Pr. Michel Dapoigny Directeurs du laboratoire : Pr. Alain Eschalier et Pr. Denis Ardid UMR/INSERM 1107 Neuro Dol, Pharmacologie Fondamentale et Clinique de la douleur 1

Introduction U1107 / Pharmacologie fondamentale et clinique de la douleur  inadequate support of chronic pain Visceral pain Abdominal pain Colonic pain First cause for gastroenterological consultation Common symptoms of IBS et IBD (period of remission) IBS : irritable bowel syndrome IBD : intestinal bowel desease

Introduction Treatment only for symptoms No real efficacity need therapeutic innovation exploration of associated factors such as hypersensitivity

Colonic hypersensitivity Introduction Colonic pain 2/3 of cases Colonic hypersensitivity Exarcerbated response to painful stimulation or not Peripheral sensitization (target organ) Dans les douleurs colique on retrouve dans 2/3 des cas une hypersensibilité colique qui peut se definir comme étant une réponse exacerbé à un stimulus douloureux ou non ou par une sensibilisation de l’organe cible. Elle a un origine mécanique puisqu’elle est décrite dans les phénomène de compression d’organe ou de distension. Pour percevoir cette hypersensibilité il existent différent senseurs. 4

Introduction Colonic Hypersensitivity Different peripheral sensors Central integration

Colonic mechanosensitivity: implication of ions channels Introduction Colonic mechanosensitivity: implication of ions channels Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010 Comme les canaux …. Cependant la mecanoperception n’est pas leurs principale fonction pour les canaux…. Pour l’instant pas de mecanosenseurs vraiment etablis. La mécano perception est une sensation commune a tous les animaux mais aussi aux plantes. 6

Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels Introduction Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010 ASICs ASICs Comme les canaux …. Cependant la mecanoperception n’est pas leurs principale fonction pour les canaux…. Pour l’instant pas de mecanosenseurs vraiment etablis. La mécano perception est une sensation commune a tous les animaux mais aussi aux plantes. 7

Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels Introduction Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010 TRPV Comme les canaux …. Cependant la mecanoperception n’est pas leurs principale fonction pour les canaux…. Pour l’instant pas de mecanosenseurs vraiment etablis. La mécano perception est une sensation commune a tous les animaux mais aussi aux plantes. 8

Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels Introduction Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010 TRPA1 Comme les canaux …. Cependant la mecanoperception n’est pas leurs principale fonction pour les canaux…. Pour l’instant pas de mecanosenseurs vraiment etablis. La mécano perception est une sensation commune a tous les animaux mais aussi aux plantes. 9

Peripheral sensors? Not clearly defined Introduction Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010 Comme les canaux …. Cependant la mecanoperception n’est pas leurs principale fonction pour les canaux…. Pour l’instant pas de mecanosenseurs vraiment etablis. La mécano perception est une sensation commune a tous les animaux mais aussi aux plantes. Peripheral sensors? Not clearly defined 10

Introduction Mecanoperception shared sensation in : Identification of a new transcription factor in case of mechanical stimulation in Arabidopsis & Poplar sp. (Equipe MECA, UMR PIAF Clermont-Ferrand) PtaZFP2

Mechanosensor in plant genetic equivalent in animal Introduction Expression précoce Il existe un equivalent genetique chez l’animal…. Martin, 2009 Mechanosensor in plant genetic equivalent in animal PtaZFP2 EGR-4 12

Introduction EGR Family: 4 subtypes (EGR-1) Transcription factor/ Early Gene Response Zinc fingers structure/ Same DNA binding sequence : GCC G/TGG GCG Largely expressed in periphery and central nervous system Description in cognitive process

Introduction EGR-4 Only two major studies  Surexpression in somatosensory cortex after mechanical stimulation.  Implication in pro-inflammatory cytokines production in T-cells. PCR EGR-4 (Mack et al., 1995).

Aim of the Study Involvement of EGR-4 transcription factor in visceral mechanosensation?

syringe and rectal probe Material and methods C57Bl6J Mice, 6-8 weeks old. Colorectal distension with100 µL (water) during10 seconds. Viscero-motor response syringe and rectal probe 20µl 40µl 60µl 80µl 100µl 16

Materials and methods samples at different time point after distension. Colon 17

Materials and methods samples at different time point after distension. Colon DRG visceral (T10-13, L6 & S1) 18

Materials and methods samples at different time point after distension. Colon DRG visceral (T10-13, L6 & S1) Spinal cord 19

Expression of EGR-4 Euthanasia distension 1h30 2h 45 min 30 min 15 min 45 min 30 min 15 min 10 min 5 min 1h

? Expression in colon, DRG Expression of EGR-4 Euthanasia distension 5 min 10 min 15 min 30 min 45 min 1h 1h30 2h  Western Blot ? Expression in colon, DRG and spinal cord

Expression of EGR-4 in colon Increase of total form of EGR-4 30 minutes after distension

Expression of EGR-4 in DRG T11-13, L6 & S1 Increase of total form of EGR-4 45 minutes after distension

Expression of EGR-4 in spinal cord Increase of total form of EGR-4 45 minutes after distension

EGR-4 Colon, DRG & spinal cord Conclusion Development new tools (PCR, WB, HIC) distension 15 min 30 min 45 min Short Time : EGR-4 Colon, DRG & spinal cord

Perspectives Future studies Long time expression (WB) mRNA expression studies (qPCR) Identification of target genes (micro-array) Female Different models of colonic Hypersensitivity post-infectious neo natal stress

Thank you for your attention Acknowledgement Monique Etienne Ludivine Boudieu Emilie Muller Agathe Gelot Frederic Carvalho Denis Ardid Thank you for your attention

Protein expression : IHC Colon Fluorecsence intensity / surface unit distension 1h30 3h30 Euthanasia DRG noyau Proprtion of immuno marqued nucleus neuron Spinal cord Fluorecsence intensity / surface unit

Localization of EGR-4 : IHC Colocalisation with sensitive fibers in DRG. Paraffine Anti-NGFI-C 1:500 Colocalisation with nervous fibers in colon