1. Competent Cell

2. Competent Cell? DNA를 받아들일 수 있는 능력을 가진 cell
효과적으로 transformation하기 위해 정상의 bacteria cell에 물리적, 화학적 처리를 가하여 외부의 DNA가 잘 들어갈 수 있도록 만든 cell

4. Competent Cell 종류
JM109 : Greatly improving the quality of miniprep DNA, and improving insert stability.
DH5α : Commonly used strain in the world,
especially for general cloning procedures.
BL21(DE3) : All-purpose strains for high-level protein expression.

5. Competent Cell 제조방법 Chemical Treatment Method CaCl2 Method
RbCl2 Method
- Ultra Competent Cell (Inoue Method)

6. Buffers for preparing competent E. coli
TFB1: mM RbCl,
50 mM MnCl2
30 mM potassium acetate
10 mM CaCl2
15% glycerol
pH 5.8 sterile-filter
TFB2: mM MOPS
10 mM RbCl
75 mM CaCl2
adjust to pH 6.8 with KOH, sterile filter

7. Positive charge of Ca2+ ions neutralizes:
CaCl2 treatment
Positive charge of Ca2+ ions neutralizes:
negative charge of DNA phosphates
negative charge of membrane phospholipids
Ca2+ 은 cell membrane의 유연성을 떨어지게 하며, 그 때 생기는 틈새로 외부의 DNA가 cell내부로 들어가는 기회를 만들어 준다.

8. <Competent bacteria cell에 의한 DNA의 결합과 도입>

9. Competent Cell 제조방법
1. Pick a single colony and inoculate 2ml of LB. Grow overnight at 37°C.
2. Add 1 ml overnight culture to 100 ml prewarmed LB medium in a 250 ml flask,
and shake at 37°C until an OD600 of 0.5 is reached (approximately 90–120 min).
3. Cool the culture on ice for 5 min, and transfer the culture to a sterile,
round-bottom centrifuge tube.
4. Collect the cells by centrifugation at low speed (5 min, 4000 x g, 4°C).
5. Discard the supernatant carefully. Always keep the cells on ice.
▶ 6. Resuspend the cells gently in cold (4°C) TFB1 buffer (30 ml for a 100 ml culture) and
keep the suspension on ice for an additional 90 min.
7. Collect the cells by centrifugation (5 min, 4000 x g, 4°C).
8. Discard the supernatant carefully. Always keep the cells on ice.
9. Resuspend the cells carefully in 4 ml ice-cold TFB2 buffer.
10. Prepare aliquots of 100–200 μl in sterile microcentrifuge tubes and freeze in
liquid nitrogen or a dry-ice–ethanol mix. Store the competent cells at –70°C.

10. Caution Cell은 OD600nm에서 0.5값을 넘기지 말 것. 왜그럴까요?
시약처리 과정 및 모든 과정에서 항상 온도 변화에 신경을 쓸 것. 왜그럴까요?
주어진 시간을 잘 지키고 pipetting할 때 천천히 조심스럽게 할 것. 왜그럴까요?
4. Contamination에 주의 할 것. 왜그럴까요?

11. Competent Cell의 이용

12. Transformation (genetics)
; DNA를 bacteria 세포 내로 주입하는 과정
Cell
DNA
Term
Prokaryote
Plasmid
Bacteriophage (virus)
Transformation
Infection
Eukaryote
Virus vector
Transfection

13. Transformation 종류 Natural Transformation
- Some bacteria (around 1% of all species)
- naturally capable of taking up DNA under natural environments.
Artificial Transformation
- Induced by laboratory procedures in which cells are passively made permeable to DNA, using conditions that do not normally occur in nature

14. Transformation Method
1. Electroporation method
- 강한 전기적 충격으로 인해 순간적으로 membrane이 깨져 생성된 구멍을 통해 DNA가 Cell로 들어감.
- 일반적으로 사용하지 않음.

15. Transformation Method
2. Heat shock method
- 반응능 세포에 순간적인 열 충격을 주어 세포 내로 플라스미드
DNA가 들어가게 하는 방법

16. Transformation의 원리
E. coli cell이 DNA를 uptake할 수 있는 상태(competent)로 만들어 주기 위해 E. coli cell을 Ca++ 과 같은 multivalent ion의 존재하에 0oC에서 incubation한다.
이때 cation은 E. coli cell membrane에 존재하는 lipid의 negatively charged phosphate와 complex를 이룰 것으로 추정된다.
 낮은 온도는 cell membrane을 응고시켜 charged phosphate의 분포를 안정화하여 cation에 의하여 효과적으로 shield되게 하여준다. 이때 37~42oC로 heat shock를 가하면 E. coli membrane 내외의 thermal imbalance가 생겨 DNA가 세포안으로 빨려들어가게 된다.

17. <Competent cell에 의한 Transformation 모식도 >

18. Antibiotics
세포벽 합성억제, 단백질 생성 억제, 세균대사 억제, Nucleic acid 합성억제 작용 등 항생제 내성이 없는 생명체가 살지 못하게 함
Selection marker로 이용
Ex) Ampicilin, penicilin, gentamicin, kanamycin

20. Antibiotic treatment

21. Method 1. Transformation 2. Competent cell → 37℃ incubation 16~18hr
1) Ice에 박은 Competent cell, DNA준비
2) Competent cell이 어느정도 녹으면 DNA를 1μl 따서 넣는다
3) Ice incubation 5min
4) 42℃ Heat shock 90sec
5) Ice incubation 5min
6) Amp+ LB plate에 spreading (불 앞에서 하고, Plate에 조, 이름쓰기)
2. Competent cell
1) Competent cell 2개 준비
2) Amp+, Amp- LB plate 에 각각 spreading
(불 앞에서 하고, Plate에 조, 이름쓰기)
→ 37℃ incubation 16~18hr
(내일 결과 확인하러 올 사람 조에서 1명씩 뽑기)

22. Introduction Result Discussion Competent cell Transformation
Antibiotics
GFP
Result
Plate 3개 사진 붙이기
Discussion
Competent cell 종류, 차이점 자세히
결과분석 intro와 연관지어서 자세히