1. Tomoki Ito Immunity 28, 870-880, June 2008
Two functional subsets of FOXP3+ Regulatory T cells in human thymus and periphery
Tomoki Ito
Immunity 28, , June 2008

2. Treg CD4+CD25+ naturally occurring Treg:
- Active suppression of autoimmunity in human and rodents
- Develop from CD4+CD8+ DP or CD4+CD8- SP in thymus
Signal through TCR from medium to high affinity for self-antigens, IL-2,
CD28
FOXP3: forkhead transcriptional-factor family: critical regulator of Treg
cell development
IL-10 and TGFβ involved in Treg cell-mediated immunosuppression?
 * CD4+FOXP3-IL-10-(Tr1): during immune response in periphery
* TGFβ-expressing Th3: oral tolerance induction to myelin basic protein
* naturally occuring FOXP3+ Treg: in thymus

3. Naïve T CD4+ Th1 Th2 Th17 : pathogenic Treg Th17 Th17 : nonpathogenic
IL-17A
IL-23
IFNr, IL-12,
IL-27
Naïve T CD4+
Th1
T-bet, STAT4, IRF1
IFNr
IL-4, IL-25
IL-12
TGF-b +Il-6
(IL-1B, IL-18, TNF-a)
GATA-3, c-maf, Jun B
TGF-b_ IL-2)
Th2
+Retinoic acid: Anti-Inflammatory Response
Inflammatory Rsponse
IFNr, Il-2, IL-4, IL-12, Il-27
RORrt, STAT3, IRF4
-Retinoic acid: Pro-inflammatory response
IL-4
IL-5
IL-13
IL-25
IL-31
IL-33
IL-6
Proinflamatory cytokines
Th17 : pathogenic
Promotes Autoimmune Disease
IL-17A, F, A/F
IL-21
IL-22
IL-26
CCL20
IL-23
Treg
Th17
IL-10
FOXP3
Prevents
Autoimmune Disease
Th17 : nonpathogenic
/regulatory
TGF-b+IL-6
TGF-b
IL-10
IL-17
IL-10, IL-17A, F, A/F

4. ICOS

5. Identification of ICOS+ and ICOS-FOXP3+ Treg cells in human thymus
FOxP3+ Treg in thymic medulla ICOS+와 ICOS-로 나눠지는 것을 봄 (FOXP3-red, ICOS-A-blue
B-green)

6. ICOS를 통해 CD4+ T cell이 prime 되면 IL-10 분비하게 되므로 두 가지 subset이 기능적으로 다른지 알아보기 위해
CD25+ICOS+
CD25+ICOS-
두 가지 subset 다
CD4+CD25- T cell
Prolifertion을 억제함 * *

7. ICOS+FOXP3+ and ICOS-FOXP3+ Treg cells in peripheral lymphoid tissues and blood
두 가지 subset이 thymus를 벗어나 periphery로 가는지 봄:
인간의 편도선과 림프절의 T-cell rich, subepithelial cell region 에 두 subset이 존재하였다
(GC에는 ICOS+ fTh cell이 많이 있지만 FOXP3는 적게 발현함)
FOXP3-red
ICOS-blue

8. CD25+ICOS+
4.02%
3.59%
2.56%
2.45%
CD25+ICOS-

9. x x x x x x x x CD127: IL-7Rα CRTH2: marker for Th2 memory cells
CD57: marker for follicular T helper cells x x x x x x x x

10. Human adult blood에는 2가지 FOXP3+ Treg의 두가지 population이 있다고 함
CD45RA+ naïve phenotype  human cord blood의 FOXP3+ Treg의 대부분을 차지
CD45RO+ memory phenotype
두 가지 ICOS subset에도 적용되는지 알아보기위해 CD45RA, CD45RO 발현을 각각 adult blood,
cord blood에서 봄
CD45RO+CD45RAlow memory
50%
100%
CD45RA+ naïve phenotype
두 가지 subset의 FOXP3+CD31+ recent thymic emigrants와의 관계를 보기 위해
두 가지 subset이 다 recent thymic emigrant를 가짐. Adult에서는 CD31발현이 적은 것을 보아
Thymic output이 현저히 감소

11. The ICOS+FOXP3+ Treg cells have the ability to produce the high amount of IL-10
두 가지 Treg subset의 cytokine production이 비슷한지 봄
방법: PMA + Iono 6시간 or anti-CD3+ anti CD28 24시간 activation해서 IL-10, IL-2생산 봄
by Facs, ELISA
Facs – intracellular cytokine staining
ELISA
CD25+ICOS+: IL-10을 4배 더 분비
Naïve, memory T cell이 Treg보다 IL-2를 더 많이 분비

12. Anti-CD3 or anti-CD3+ICOSL으로 5일 activation  Treg cell의 cytokine 분비 봄
Facs – intracellular cytokine staining
ELISA
Treg이 stimulation전보다 Il-2를 더 분비하지만 여전히 T cell보다는 적다
ICOS+가 47-76% IL-10생산
ICOS-가 8-16% IL-10생산

13. ICOS+FOXP3+ Treg이 다른 CD4+ T cell subset보다 IL-10 더 분비하나?
 CD45RO+ memory T cell 의 모든 subset에서
IL-10분비 봄
CD45RO+ICOS+ memory cell이 IL-10을 가장 많이 분비
5 day priming
 ICOS+ Treg이 IL-10을 가장 많이 분비 ⇒ circulating CD4+ T cell pool에서 가장 많이 IL-10분비

14. The ICOS-FOXp3+ Treg cells express greater amounts of TGFβ than other CD4+ T cells
TGFβ가 FOXP3+Treg의 immunosuppression에 가장 중요한 분자임!
 Activation 후 mTGFβ의 발현을 봄
Quantative RT-PCR로 TGFβ의 mRNA 발현 정도 확인
CD4+CD25+FOXP3+ natural Treg이
2가지 subset으로 나눠지는 것 확인

15. ICOS+FOCp3+ and ICOS-FOXp3+ Treg cells use different molecular mechanisms for suppression
두가지 subset이 다른 기능할까?
A. CD4+CD45RO-CD25- naïve T cell이
Allogeneic DC와 culture 됐을 때
ICOS+Treg, ICOS-Treg에 의해
Proliferation 저해 받는다
B.ICOS+:
αIL-10, αTGFβ –각기 조금 inhibition block…
둘 다 쓰면 완전히 block
ICOS- Treg은 αTGFβ inhibitor만 써도 function이 block됨  cell-cell contact suppression !

16. ICOS+는 mTGFβ와 soluble IL-10
Suppression을 둘 다 이용
DC의 CD86발현이 ICOS+ Treg에 의해 저해된다..
αIL-10으로 회복됨
ICOS+Treg은 DC성숙을 막기 위해
IL-10을 이용
Transwell system에 의해 ICOS-Treg
function이 막힘

17. Survival and preoliferation of -ICOS+FOXP3+ and ICOS-FOXP3+ Treg cells are differently regulated
Peripheral ICOS+Treg과 ICOS-Treg의 survival, expansion이 다르게 조절되나?
ICOS+는 ICOS신 호 없으면 IL-2에 의해 apotosis를 많이 일으킴
IL-2 culture for 5 days
ICOS-: ICOS, anti CD28에 의한 proliferation
ICOS+: ICOS에 의한 proliferation
다른 costimulatory molecule에 의해 survival, proliferation조절됨

18. Plasmacytoid DCs but not myeloid DCs promote the proliferation of ICOS+ Treg Cells through ICOSL
Plasmacytoid DC(pDC): ICOSL을 발현 ….after activation
Myeloid DC(mDC): CD80, CD86을 발현
mDC는 naïve CD4+를 prime해서 IL-10을 분비하는 cell로 분화하게 함
pDC와 mDC가 두 Treg subset의 proliferation을 다르게 조절하나?
*pDC는 ICOS+Treg의 proliferation 조절
*mDC는 ICOS-Treg의 proliferation조절

19. Summary
Identification of naturally occurring FOXP3+ Treg cells 의 two subsets: * ICOS+FOXP3+: -use IL-10 to suppress dendritic cell (DC) function and TGF-b to suppress T cell function -survival signal through ICOS Tr1 * ICOS-FOXP3+: -use TGF-b mainly -survival signal through CD28 Th3