1. IMMUNOGENICITY OF BIOLOGICS
Séminaire de Communication Scientifique
Faculté de Pharmacie de Lille
DESPRES Chloé
NOURRY Sandra
OLIVIER Agathe
20 février 2014
IMMUNOGENICITY OF BIOLOGICS
Prediction tools & Risks assessment
CSA Biopharm

2. Chief Scientic Officer
CSA Biopharm
CEO
Chief Scientic Officer
Chief Medical Officer
Goal : to develop the pipeline in biotechnologies
Just discovered a new mouse mAb for Alzheimer’s disease
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3. Chief Scientic Officer
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CEO
Chief Scientic Officer
Chief Medical Officer
Mot clé = préclinique
We want to be sure there will be no immunogenicity problems that could stop the development during the clinical trials and later.
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4. Humanization
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5. Humanization : HOW ? Goal : Human antibody (80%) :
reduce immunogenicity
En bleue : un anticoprs murin, violet Ac chimerique et jaune Ac humanisé. On étudie la réponse Anti anticorps (qui peut neutraliser notre produit, et donc perdre son activité, créer des EI,…)
On un séparé les réponse en 3 : réponse antiAc négligeable, tolérable ou marquée. On voit qu’avec l’Ac murin on a peu de reponse négligeable ou tolerable mais beacoup de réponse marquée, ce qui indque une forte immunogenicité. Avec le chimérique on a beacoup plus de réponse négligeablemais avec encore des réponses marquée.
Alors qu’avec un Ac humanisé on a beaoucp de reponse négligeable ou tolérable et peu de réponse marquée donc l’humanisation a permi de reduire l’immunogenicité.
AHAM : anticorps humains anti-anticorps murins
AHAC : anti-corps humains anti-anticorps chimériques
AHAH : anticorps humains anti-anticorps humanisés
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6. Reported immunogenicity
Examples
Antibody name
Company
Type
Target
Indication(s)
Reported immunogenicity
Infliximab (REMICADE)
Centocor (J&J)
Chimeric
TNFα
RA/Crohn
10-15%
Panitumumab (VECTIBIX)
Amgen
Human
EGFR
Colorectal Cancer
4,6%
Ustekinumab (STELARA)
IL12-IL23
Plaque Psoriasis
3-5%
Adalimumab (HUMIRA)
Abbott
RA/Crohn/
Ankylosing spondylitis/
plaque psoriasis…
2.6%–26%
Matthew P Baker et Al. Immunogenicity of protein therapeutics:The key causes, consequences and challenges. Self/Nonself 1:4, ; October/November/December 2010 © 2010 Landes Bioscience

7. Humanization : HOW ? Goal : Risk :
Murines CDR (20%) : responsible for the desired binding properties
Risk :
Decrease of affinity and activity.
Creation of new epitope T at junctions and induced immunogenicity and side effects.
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8. Humanization : illustrating
Not just insert murines CDR
PAUL CARTER et al.Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy.
la plupart des anticorps humanisés réalisés par greffage des régions CDR n’ont plus la même affinité pour l’antigène que l’anticorps murin, en raison du rôle majeur de certains acides aminés des régions adjacentes aux CDR (FR, framework) dans la structure du site de liaison de l’antigène.
Pour conserver cette structure, il est donc nécessaire de greffer dans l’anticorps accepteur non seulement les régions CDR de l’anticorps murin donneur, mais aussi les acides aminés de la région charpente de l’anticorps donneur.
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9. Reported immunogenicity
Examples
Antibody name
Company
Type
Target
Indication(s)
Reported immunogenicity
Infliximab (REMICADE)
Centocor (J&J)
Chimeric
TNFα
RA/Crohn
10-15%
Panitumumab (VECTIBIX)
Amgen
Human
EGFR
Colorectal Cancer
4,6%
Ustekinumab (STELARA)
IL12-IL23
Plaque Psoriasis
3-5%
Adalimumab (HUMIRA)
Abbott
RA/Crohn/
Ankylosing spondylitis/
plaque psoriasis…
2.6%–26%
Matthew P Baker et Al. Immunogenicity of protein therapeutics:The key causes, consequences and challenges. Self/Nonself 1:4, ; October/November/December 2010 © 2010 Landes Bioscience

10. Immune Response to Therapeutic Protein : Why is it important ?
Development of Anti-Drug Antibody (ADA)
Affect both efficacy and safety of the product
Result in reduced efficacy and sometimes of a complete lack of a clinical response
Result in adverse events (benign to life-threatening)
Hypersensibility…
Mais pouquoi est-ce si important de regarder si une protéine thérapeutique peut entrainer une réponse immuntaire ?
Lors d’une réponse immunitaire, il y a une production d’anticorps anti-protéine thérapeutique (également appelés ADA) et ces ADA peuvent avoir des conséquences sur l’efficacité et la sécurité du produit.
Concernant l’efficacité, ils pourront entrainer une diminution de celle-ci voire même totalement rendre inefficace le médicameent
Concernant la sécurité, les ADA peuvent etre à l’origine d’effets indésirables pouvant menacer la vie du patient. On aura par exemple des réactions d’hypersensibilité
C’est quelque chose dont on se rendra compte très tardivement dans le développement clinique. Ca peut etre une catastrophe.
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11. And for the regulatory agencies ?
Widespread use therapeutic proteins has demonstrated that
nearly all biologicals can elicit antibody responses
Animal models are not predictive for immunogenicity : development of anti human protein antibody
FDA & EMA demand :
No production of ADA causing adverse effect
L’augmentation de l’utilisation des protéines thérapeutiques a permis de comprendre qu’en réalité, pratiquement toutes ces protéines thérapeutiques peuvent initier une réponse immunitaire chez l’homme.
Et on se rend compte de ces problèmes d’immunogénicité que tres tard dans le développement. Ce qui peut etre une catastrophe pour le labo car ça veut dire que toute la recherche tombe à l’eau.
On veut donc essayer de prévenir ou de diminuer un maximum ces problemes durant le développement du médicament.
Le problème c’est que les modèles animaux ne peuvent pas etre utilisés car ces derniers vont forcément développer des AC anti protéines humaines. On ne peut donc pas utiliser les animaux pour prédire la réponse immunitaire de l’homme.
Donc on va voir comment on peut faire, avec quelles méthodes on peut essayer de prédire ces réactions d’immunogénicité.
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12. Immunogenicity : Predictive Tools
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13. … The Immunogenicity mechanism
But before…
… The Immunogenicity mechanism
Alors on est persuadé que toute le monde se rappelle très bien des mécanismes immunogène mis en jeu, mais pour les 2-3 personnes qui ne savent plus trop, on va vous faire un rappel, de façon à ce que tout le monde puisse comprendre la suite de l’exposé…
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14. How does it work ? CD/LcB http://www.youtube.com/watch?v=Mn9_sgUnemk
Alors depuis le début on vous parle d’AC anti protéine thérapeutique, les voila… est-ce qu’on pourrait essayer de prévoir la production des AC et empecher leur reconnaissance aux protéines thérapeutiques ? Eh bien non, ça serait trop facile, c’est quelque chose qu’on est pas capable de faire, c’est trop compliqué.
On va donc plutôt regarder ce qui se passe avant la production des AC, sur quelle étape on pourrait éventuellement jouer.
Voici notre protéine thérapeutique qui se retrouve dans le compartiment sanguin….
On a donc notre protéine thérapeutique dans le sang du patient. Elle est pris en charge par les cellules présentatrices d’Ag, en particulier les CDs. Ces dernieres vont couper la protéine thérapeutiques en plein de petits morceaux = c’est le processing. Dans la cellule, il y aura association des peptides ainsi formé avec le CMH de classe 2, et l’ensemble va migrer à la surface de la cellule. Les LcT CD4 via leur TCR vont reconnaitre le peptide présenté par le CMH 2. Cette reconnaissance ainsi que des signaux de co-stimulation vont permettre l’activation du LcT. L’activation du LcT se traduit en la prolifération de LcT et en la production du cytokines comme l’IFNg, et l’IL-4
Le LcT qui est un LcT helper va également participer dans un complexe de coopération cellulaire avec les LcB ce qui va permettre la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes sécrétant des anti corps anti protéine thérapeutique.
Visionnage de la vidéo
Donc tout ça c’est bien beau, mais comment est-ce qu’on peut essayer de prévoir la production de ces ADA. On déjà comme on l’a vu, les ADA ne sont produits que s’il y a une coopération cellulaire entre les LcB et les lcT activés. Et pour que les LcT soient activés, il faut que toutes les étapes vues précédemment soient réalisées. De ce fait la, si on arrive à détecter le fait que l’une de ces étapes a lieu, alors, on pourra se dire qu’il y a un risque de production d’ADA.
Le but, ça va donc etre de regarder chacune de ces étapes séparémment, de voir si elles se produisent et si c’est les cas, de voir comment on peut faire pour qu’elles ne se produisent pas…
The process of raising an immune response to a protein drug involves several recognition events and signals : (1) protein uptake by antigen presenting cells (APCs), (2) protein antigen processing, (3) interaction between APCs and T-cells, including formation of peptide-major histocompatibility complex (HMC)-T-cell receptor (TCR) complexes in the presence of costimulatory signals such as those from infection of inflammation, (4) T-cell maturation, (5) interaction between T-cells and B-cells, including protein binding to B-cell receptors and formation of peptide-MHC-TCR complexes, (6) B-cell maturation, including isotype switching and affinity maturation, and (7) antibody binding to the protein drug. Blocking any of the above steps can reduce the immunogenicity of protein therapeutics.
Ici on parle des T cell help = T cell thymus dép. Ce process implique présentation d’Ag, T cell, sécrétion cytok, B cell (Ac)
Cette Td activation est caractérisée par switch IgM  IgG et prod d’Ac de hte affinité, robustes et av longue durée de vie
Ce qui initie la qlité et qtité de rép T cell = peptide processing et abundance, intracellular editing and MHC loading by the DM protein, peptide-MHC stability, phenotype of the responding T cell, presence/absence of secondary signals
On veut pas d’ADA. On regarde toutes les étapes d’activation des cellules T pour vérifier ça.
ATTENTION : ON NE CHERCHE PAS A BLOQUER UNE DE CES ETAPES !!!
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15. How does it work ?
Blocking any of the above steps can reduce the immunogenicity of protein therapeutics
Elimination of T-helper epitopes will reduce ADA development so immunogenicity
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16. Immunogenicity tests
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17. T Cell Epitope Antigenicity Profiling
In silico assays
In vitro assays
Class II HLA binding assays
Antigen presentation assays
T cell proliferation assays
Cytokines release assays
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18. Immunogenicity tests In silico
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19. In silico binding prediction
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20. In silico binding prediction
PIEGE A LOUP
Macromolecular Modeling Blog ™
Zavala-Ruiz Z et al. PNAS 2004;101:
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21. In silico binding prediction
Goal : prediction of MHC II/ peptide interaction
Ab is virtually splited  peptides
Peptides created are shifted by 1 amino acid
AEYILPMKFDVSKLGFQ
AEYILPMKFDVS
EYILPMKFDVSK
YILPMKFDVSKL
ILPMKFDVSKLG
Polymorphisme du CMH II : il existe de nombreux allèles différents qui se traduisent par des syst différents de reconnaissance
LPMKFDVSKLGF
PMKFDVSKLGFQ
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22. In silico – Results
Figure 1 HLA Class II epitope map of the FVIII C2 domain as predicted by EpiMatrix. EpiMatrix-predicted 9-mer hits for 8 prevalent
HLA class II alleles are aligned along the human FVIII C2 sequence. Any peptide scoring above 1.64 on the EpiMatrix “Z” scale (top 5%)
is considered to be a potential epitope (gray bars). Peptides scoring above 2.32 on the scale (top 1%) are extremely likely to bind MHC
(black bars). Published epitopes determined by experimental methods are similarly aligned (blue bars). EpiMatrix identified clusters
of epitopes spanning residues 2191–2210, 2231–51, 2254–69, 2271–89, 2299–2317 and 2310–30 that are framed in blue. The EpiMatrix
algorithm finely maps the positions of published epitopes.
Séquence de 9-10 ac aminés
Analysis focused on as few as 8 representatives of the 875 known HLA-DR alleles can « cover » the genetic backgrounds of most humans worldwide
L. Moise et Al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo.ClinicalImmunology (2012) 142, 320–331
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23. Deimmunization YILPMKFDVSKL YGLPMKFDVSGL
Identify and eliminate T-cell epitopes from the variable region sequences of antibodies and proteins.
YILPMKFDVSKL
YGLPMKFDVSGL
Alors que le 1er venait s’ancrer dans les poches du MHC, le peptide déimmunisé ne peut plus s’ancrer
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24. De-immunization : it is working!
Figure 2 Binding of C2 peptides to HLA alleles. In 96-well plates, non-biotinylated test peptide at a concentration of 100 μM competes
for binding to purified Class II molecules (50 nM). Bars are averages across alleles. Dots represent percent inhibition of binding
to HLA alleles: DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701 and DRB1*1501. The amino acid modifications were made to prevent
binding across all HLA DR alleles; however, the predicted changes were not always universal and therefore some peptides could be
expected to demonstrate residual binding to selected MHC.
F = phe remplacé par G = gly (pas de chaines lat donc plus de point d’ancrage)
Quand on fait la mutation, le traceur se fixe mieux au CMH au dépend de notre pept qui s’y fixe moins
L. Moise et Al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo.ClinicalImmunology (2012)
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25. In Silico Strengths and Limitations
High throughput
No proof of TCR interaction
Low cost
Consequences of this interaction? (production of Ab or T rég, affinity…)
Reduce downstream in vitro testing
No proof of real interaction
Opportunity in early development to modify a protein to decrease its immunogenic potential
Post translationnal modifications : deimination, deamidation, oxydation, dimerization…..

26. Immunogenicity tests In vitro

27. Class II HLA-peptide Binding Assay
1)Custom peptide synthesis
Generated as an over lapping peptide library from a known protein
Epitope can be chosen from a limited selection of known protein (pre-screening)
Provides by Custom Peptid Library : peptids 6-20 a.a. are synthetised in 0,5-2 mg, quality control
Library ready in days
2)MHC peptide binding assay
Comparing to a positive and intermediate control
Detection based on presence/absence of the native conformation of the MHC peptide complex
Score reported quantitatively as a percentage of the signal generated by the test peptide versus the positive control peptide

28. Class II HLA-peptide Binding Assay
Il existe différentes techniques de HLA binding dont une où on peut obtenir des données cinétiques (Kon et Koff) ce qui peut être intéressant car si prot a Kon et Koff rapide, il y a peu de chance que ça entraine une immunogénicité
« on synthétise les peptides PHYSIQUEMENT »
Goal :
Determines the ability of each candidate peptide to bind class II HLA alleles and to stabilize the HLA-peptide complex

29. HLA Binding Assay Strengths and Limitations
Straight forward & Easier
No proof of TCR interaction
Improve accuracy of immunogenicity predictions before using biological assay
Artificial processing
Purity : greater than 90%

30. Antigen Presentation Assays
1)Custom peptide synthesis
Generated as an over lapping peptide library from a known protein
Epitope can be chosen from a limited selection of known protein (pre-screening)
Provides by Custom Peptid Library : peptids 6-20 a.a. are synthetised in 0,5-2 mg, quality control
Library ready in days
2)MHC peptide binding assay
Comparing to a positive and intermediate control
Detection based on presence/absence of the native conformation of the MHC peptide complex
Score reported quantitatively as a percentage of the signal generated by the test peptide versus the positive control peptide

31. Goal
Measure directly MHC-peptides presentation on DCs cultured with protein of interest.
Determine which portions of the drug, are processed and presented to MCH.
Determine the peptides sequences that are processed and presented.
Compare proteins, protein formulations and the effect of donor HLA types.
Compatible with fully-formulated biologics.
ADVANTAGE :
Tells exactly which epitopes from the biotherapeutic drug or other protein of interest are presented to MHC.
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32. How does it work ?
Culture of the protein of interest with DCs.DCs take up the protein and process it
HLA molecules present epitopes from the protein on the DC surface. 
Cells are lyzedand HLA-peptide molecules are then recovered in an immune affinity step
Protein is supplied by the customer
A panel of HLA-typed, healthy donor peripheral blood mononuclear cell (PBMC) samples are prepared from the ProImmune tissue bank (selected to reflect HLA distribution of choice)
Monocytes from donor PBMC are cultured in defined media and differentiated to produce dendritic cells (DC)
DC are loaded with the test antigen and induced to mature
DC are harvested, HLA molecules are purified and the associated peptides are eluted
Peptide samples are analyzed by sequencing mass spectrometry
The mass spectrometry data is compared against a protein database library consisting of the sequence of interest and the international protein index (IPI) of the organism of choice
Peptides are ranked by significance according to a probability based algorithm
Data are verified by searching against a scrambled decoy database to reduce false positives
A full data report is compiled, listing all detected epitopes including presentation of nested epitope sets and anchor analysis against characterized HLA alleles with a summary of detected control proteins.
Delivery time can be approximately 6 weeks, depending on the scope of the project
and analyzed by sequencing mass spectrometry. 
Peptides are recovered from the HLA  
Peptides identified by mass spectrometry are subjected to analysis to identify true positive peptides with high confidence.
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33. Humira® example
The label for Humira®indicatesthat the incidence of ADA has been measuredat 1-12%.
A recent publication shows thatitcanbe more than 50% after 28 weeks of treatment.

34. Humira® example
3 potential epitopes were identifie dusing Antigen Presentation Assays analysis of epitopes presented by HLA-DR, including one (DNAKNSLYLYLQMNSLRAEDTA) which was presented by a range of donors of different HLA-DR types.

35. Humira® example

36. Antigen Presentation Assay Strengths and limitations
Inform about natural antigen processing.
No proof of TCR interaction and T cell proliferation
Assessment of MHC peptide binding
Rapid way to identify sequences of key relevance for the immunogenicity.

37. T-Cell Activation La mesure du complexe
Utilization of bulk cultures of PBMC, either with or without costimulatory signals

38. T-Cell Activation
Principe : measure of peptide/TCR/BCR binding is impossible
Measure of its consequences
2 methods :
Fluorescent marker dilution
Measure of cytokine release

39. T-cell proliferation – Fluorescent marker dilution
Dans cet assai on a donc les 3 acteurs :
La protéine thérapeutique
La cellule dentritique
Le lymphocyte T chargé en marqueur fluorescent : le CFSE
Ces 3 acteurs sont donc mis en culture ensemble, la cellule dendritique va capter la protéine, la processer et presenter des peptides au TCR. Si ces peptides sont immunogènes, il y aura proliferation des LcT et donc dilution ou partage de la fluorescence dans ces LcT. On passe d’une cellule fortement fluorescente à 2 cellules un peu moins fluorescents.
CD8+ T cell-depleted and CFSE-labeled donor PBMC are cultured with 5µM of each peptide of interest for 7 days in six replicate wells. Each assay plate includes a set of untreated control wells. The assay also incorporates reference antigen controls, comprising synthetic peptides for known MHC class II antigens, and two potent whole protein antigens.
Based on dilution of a fluorescent dye (cell division)
Advantages in terms of ease-of-use
Using whole protein or synthesized peptide
Flow Cytometry

40. T-cell proliferation – Fluorescent marker dilution
En bas on a l’échelle de fluorescence. Plus on est à droite, plus les CD4 sont fluorescent.
Quand la cellule n’est pas stimulée, on a donc bcp de fluorescence
Quand elle est stimulé, on a donc une dilution de la fluorescence. C’est-à-dire qu’on a de nouveau LcT qui fluorescent un petit peu.
Et dans notre essai ici, on peut voir qu’on a très peu de faible fluorescence, donc peu de prolifération des LcT ce qui veut dire qu’on a peut etre trouvé une protéine thérapeutique faiblement immunogène.

41. Cytokine Release Assay
PRINCIPLE :
ELISA Sandwich
Pour regarder si on a une libération de cytokines, on fait simplement un test ELISA
C’est un test assez simple par rapport à ceux qu’on a vu précédemment. En fait les cytokines produites par les LcT activés vont être captés par des AC anti-cytokines. Alors on peut choisir de capter une cytokine en particulier comme l’IL-6. Et puis ces cytokines seront mis en évidence par des AC anti cytokines qui sont marqués.
ELISA = measure cytok level in culture supernatants generated under conditions of T cell stimulation  information about magnitude (how much cytok?) + type + quality of the response (which cytok?)
ELIspot = number of cytok-producing cells within a cell population stimulated ex vivo. More sensitive and more quantitative

42. Results PBS SEB X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9
Ici on a un exemple de résultats concernant la production d’IL-6. Chaque point représente la quantité d’IL-6 trouvé dans un échantillon de sang correspondant donc à un patient (donc à un HLA). Le 1er c’est le témoins négatif (PBS), le 2ème, c’est le témoin positif (SEB). Donc on Remarque qu’avec le témoin négatif, on a bien pas de production d’IL6, et avec le témoin posifitf, on a bien une production d’IL-6 donc la moyenne est représentée par ce trait rouge.
Concernant notre essai, on a donc 2 peptides pourlesquels il y a une production de cytokine : le X7 et le X9.
IL-6 responses from a cohort of 29 donors, stimulated with (left to right) Remicade®, aggregated Remicade®, Erbitux®, Campath®, Herceptin® and Vectibix®, at a range of concentrations.  Medians are indicated by red lines.
PBS
SEB X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9

43. T-cell Activation Assay Strengths and limitations
Brings together all the partners of immunogenicity
Risk of variability
Difficulties of reproductibility
Incorporate Ag natural processing and presentation pathways
Overestimation of the frequency of activated T cells
Number of individual blood (PBMC) is quite large (> 40)
 HLA diversity of a patient population
Composition of the cells in culture (immature/mature DCs, T and B cell, monocyte derived macroph) may improve the ability of a protein to initiate and propagate IR
It is recommended to utilize at least two independent readouts of T cell activity
Irrelevant = sans rapport avec

44. TESTS - summary In silico In vitro
Algorithm to screen for potential T-cell epitopes
Identify linear motifs of 9-10 amino-acids that bind to MHC Class II molecules
Fast, extensive databases exist
Tend to over-predict potential for immune response relative to in vitro- methods
Typically used as part of lead selection/optimization
In vitro
HLA binding assays
Antigen Presentation Assay
T cells assays
Peptides or proteins
Throughput = débit
Extensive = complet

45. Relies on combination of several assay

46. Choice of the best mAB (Safety/Efficacy)
Decision Tree
+ affinity assays
 efficacy
Humanized mAB
De-immunization beginning
modifications
immunogenic sequences ? (In silico tests)
« in silico » High immunogenicity
« in silico » Low immunogenicity
Overlapping peptides production
HLA-binding test
Ag Presentation test
T-cell activation test
High immunogenicity
Low immunogenicity
Mouse model : souris transgénique dont le système immunitaire a été humanisé….
Quand Ac choisit et que c’est fini, besoin d’un process manufacturing pr le produire et le mettre sur le marché ; ATTENTION manufacturing process nécessite plusieurs étapes (régulation de l’expression des gènes, purification, formulation…) où à chacune d’elle, potentiel d’introduction de modif biochim ou biophys pouvant influencer le profil d’immunogénicité du prod
CLINICAL TESTING IS THE ONLY WAY TO « VALIDATE » ANY OF THE METHODS DISCUSSED HERE
Guidelines for standardizing immunogenicity testing of PT are emerging
No single method is a definitive tool for determining if the PT will elicit an immune response
mAB candidates
Choice of the best mAB (Safety/Efficacy)
Mouse model
Olinoudezumab

47. Thank you for your attention !
Question ?