1. Protein Work 2004, 9, 4 Koo Na Youn
Protein Work 중 일부인 단백질의 상호작용 연구방법인 면역침강 방법을 중심으로 단백질 시료의 준비부터 detection 까지의 과정을 중심으로 발표를 하겠습니다.
2004, 9, 4
Koo Na Youn

2. Cell and tissue homogenization
Protein Work
Cell and tissue homogenization
Lysis buffer
Cell Lysis
Protein concentration determination
Immunoprecipitation
SDS-PAGE & Western blotting
culture cell 혹은 tissue 를 homogenization과 lysis 하는 방법들을 간단히 소개하고, 준비된 단백질 시료의 농도를 측정하는 방법, 면역침강 과정
끝으로 western blot 과정을 중심으로 살펴보겠습니다.

3. Cell and tissue homogenization
Protein 시료 준비의 첫번째 과정은 tissues와 cell을 깨부수는 일입니다. Buffer에 suspension된 tissues와 cell은 기계적 방법 즉 homogenization에 의해 plasma membrane을 파괴하여 cell contents을 방출시킬수 있습니다. 기계적 방법으로는 frequency sound 를 이용해서, 큰 압력가해 세포를 작은 구멍을 통과하게 하여 깨는 방법, 그리고 shearing 방법으로 cell의 plasma membrane을 파괴 시킬수 있습니다. 또한 화학적 방법으로는 detergent를 처리하여 plasma membrane을 파괴할 수 있습니다. 세포를 파괴한 결과물을 homogenate 혹은 extract라 하며, 그 속에는 enzymes, ribosomes, metabolites들이 포함되어있어 protein은 효소작용에 의해 degradation 되거나 물리 화학적 원인에의해 변성이 일어날 수 있습니다. 그래서 그러한 작용들을 최소화하기 위한 lysis buffer를 사용하게 됩니다.

4. Lysis Buffer Base Ingredients Protease Inhibitors
Tris-HCl (buffering agent prevents protein denaturation)
NaCl (prevents non-specific protein aggregation)
NP-40 (non-ionic detergent; 10% stock solution in H20)
Na-deoxycholate (ionic detergent; 10% stock solution in H2O; protect from light)
Protease Inhibitors
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) (200 mM stock solution in isopropanol; store at room temperature)
EDTA (calcium chelator; 100 mM stock solution in H2O, pH 7.4)
Leupeptin (store frozen in aliquots, 1 mg/ml in H2O)
Aprotinin (store frozen in aliquots, 1 mg/ml in H2O)
Pepstatin (store frozen in aliquots, 1 mg/ml in methanol)
Phosphatase Inhibitors
Activated Na3VO4 (200 mM stock solution in H2O; Activation of Sodium Orthovanadate)
NaF (200 mM stock solution; store at room temperature)
Lysis buffer 일반적으로 Tris buffer를 사용하는데 Tris는 단백질의 denaturation을 막아주며, NaCl는 non-specific protein aggregation을 막아줍니다. 그리고 detergent NP-40과 Na-deoxychalate가 있습니다. kinase assays를 할 경우에는 Ionic detergent는 protein을 denature시켜 활성을 없애기 때문에 사용하지 않는 것이 좋습니다. Lysis buffer는 기본 조성에 목적에 맞게 modify해서 사용할 수 있고, 대부분의 경우 protease inhibitors를 넣어 protein의 enzyme에 의한 degradation을 줄일 수 있습니다. 주로 사용하는 protease inhibitor로 PMSF, EDTA, Leupeptin, Aprotinin, pepstatin등이 있으며, EDTA는 enzyme 활성화에 필요한 free metal ions을 chelating 하여 metalloproteases를 억제할 수 있습니다. 그리고 다른 inhibitor들과는 달리 PMSF는 H20에서 불안정하기 때문에 사용직전에 넣어서 사용합니다.
다음으로 phosphatase inhibitor는 Na3VO4와 NaF가 있으며, phosphatase assays 를 할 경우에는 phosphatase inhibitor는 사용하지 않습니다. Na3VO4는 특별히 activation 시켜서 그 효과를 더 증가 시킬 수가 있습니다.

5. Activation of Sodium Orthovanadate
Lysis Buffer
Prepare a 200 mM solution of Na3VO4.
Adjust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. At pH 10.0 the solution will be yellow.
Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes).
Cool to room temperature.
Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 2, 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0.
Store the activated sodium orthovanadate as aliquots at -20℃.
Reference: Gordon, J., Methods Enzymol. 201: , 1991
[Note: This procedure depolymerizes the vanadate, converting it into a more potent inhibitor of protein tyrosine phosphatases.]
Sodium Orthovanadate의 activation은 200mM solution을 만든 후 pH10.0으로 맞추면 노란색으로 변하게됩니다.이를 색이 사라질때까지 약 10분정도 끓이고 상온에서 식힌 후 더 이상 색이 변하지 않을때 까지 2, - 4번 과정을 반복하여 pH10.0으로 안정화 시켜 vanadate를 depolymerization 시켜 효과를 최대화 할 수 있습니다.

6. Preparation of Modified Radioimmunoprecipitation (RIPA) Buffer
Lysis Buffer
Preparation of Modified Radioimmunoprecipitation (RIPA) Buffer
The final concentrations in the modified RIPA buffer should be:
Tris-HCl : 50 mM, pH 7.4
NP-40 : 1%
Na-deoxycholate : 0.25%
NaCl : 150 mM
EDTA : 1 mM
PMSF : 1 mM
Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 μg/ml each
Na3VO4 : 1 mM
NaF : 1 mM
Store RIPA buffer at 2-8℃ until ready to use.
위의 lysis buffer를 RIPA buffer라고 하고 최종 modified RIPA buffer는 다음과 같고 냉장보관 하여 사용하고, 특히 PMSF의 경우는 H2O에서 불안정하므로 사용하기 직전에 넣어 사용합니다.

7. Preparation of Cell Lysate
Cell Lysis
Wash adherent cells twice with ice-cold PBS. Wash non-adherent cells in PBS and centrifuge at 800 to 1000 rpm in a table-top centrifuge for 5 minutes to pellet the cells.
Add ice-cold modified RIPA buffer to cells
Scrape adherent cells. Transfer the cell suspension into a centrifuge tube. Gently rock the suspension on either a rocker or an orbital shaker in the cold room for 15 minutes to lyse cells.
Centrifuge the lysate at 14,000 x g in a precooled centrifuge for 15 minutes. Immediately transfer the supernatant to a fresh centrifuge tube and discard the pellet.
Dilute the cell lysate at least 1 : 10 before determining the protein concentration
다음은 cell lysis 과정입니다. Cell을 ice-cold PBS로 washing 한 후 modified RIPA buffer를 넣고 cell을 scrape한후 micro tube에 넣고 cold room에서 15분가 agitation 하면 buffer의 detergent에 의하여 plasma membrane이 파괴되어 cell extract를 얻을 수 있습니다. Cell debris를 제거하기 위해 4도시 14000xg 혹은 12500rpm에서 원심분리하여 pellet을 버리고 상등액을 회수하여 protein 농도를 측정합니다.
because of the interference of the detergents in the lysis buffer with the Coomassie-based reagent. At this step, the sample can be divided into aliquots and stored at -20℃ for up to a month.
TIP: When working with large volumes of non-adherent cells, the cells may not be cooled quickly enough to maintain the activity of the protein being studied. In this case, pour the cell suspension into a mixture of an equal mass of 2 x PBS and ice, then collect the cells by centrifugation and perform the lysis as described above.

8. Protein Concentration Determination
Protein-dye conjugate: Absorbs light differently than the dye alone
Quantified: spectrophotometer
Bradford
Coomassie Blue G-250
Lowry
Bicinchoninic Acid (BCA)
단백질 정량은 protein과 dye가 결합되면 본래 dye가 갖는 흡광 파장과는 달라지는 원리를 이용하여 spectrophotometer로 흡광도를 측정하여 정량을 할 수 있습니다. Dye와 단백질의 반응이 포화되지 않는 한 Dye와 결합하는 단백질이 많을 수록 색이 진해지고 흡광도는 커집니다. 단백질을 정량하는 방법으로는 크게 Bradford, Lowry, BCA 방법이 있습니다.

9. Protein Concentration Determination
Bradford Assay
The change in absorbance in Coomassie Blue G-250 upon binding of protein
Not susceptible to interference by a wide variety of chemicals present in samples.
The notable exception is high concentrations of detergents.
Bradford 방법은 Coomassie blue dye를 단백질과 반응 시켜 흡광도를 측정하는 방법이며, sample 내의 chemical에 의해 영향을 받지 않지만 높은 농도의 detergents에 의해서는 반응이 저해될수 있습니다.

10. Lowry & Bicinchoninic Acid (BCA)
Protein Concentration Determination
Lowry & Bicinchoninic Acid (BCA)
BCA reduces divalent copper ion to the monovalent ion under alkaline conditions, as is accomplished by the Folin reagent in the Lowry assay.
The advantage of BCA is that the reagent is fairly stable under alkaline condition, and can be included in the copper solution to allow a one step procedure.
A molybdenum/tungsten blue product is produced as with the Lowry.
Lowry와 BCA 방법의 기본 원리와 특징이 비슷하며 여러 과정을 거쳐야 하는 Lowry 방법을 one step으로 개선한 방법이 BCA 방법이라고 말할 수 있으며, Bradford방법에 비해 더 낮은 단백질 농도 측정이 가능합니다.
Stoscheck (1990) has suggested that the BCA assay will replace the Lowry because it requires a single step,
The principle behind the Lowry method of determining protein concentrations lies in the reactivity of the peptide nitrogen[s] with the copper [II] ions under alkaline conditions and the subsequent reduction of the Folin-Ciocalteay phosphomolybdicphosphotungstic acid to heteropolymolybdenum blue by the copper-catalyzed oxidation of aromatic acids [Dunn, 13]. The Lowry method is sensitive to pH changes and therefore the pH of assay solution should be maintained at
The Lowry method is sensitive to low concentrations of protein. Dunn [1992] suggests concentrations ranging from mg of protein per mL while Price [1996] suggests concentrations of mg of protein per mL. The major disadvantage of the Lowry method is the narrow pH range within which it is accurate. However, we will be using very small volumes of sample which will have little or no effect on pH of the reaction mixture. A variety of compounds will interfere with the Lowry procedure. These include some amino acid derivatives, certain buffers, drugs, lipids, sugars, salts, nucleic acids and sulphydryl reagents [Dunn, 1992]. Price [1996] notes that ammonium ions, zwitterionic buffers, nonionic buffers and thiol compounds may also interfere with the Lowry reaction. These substances should be removed or diluted before running Lowry assays.
Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay (Smith)
Considerations for use
The bicinchoninic acid (BCA) assay is available in kit form from Pierce (Rockford, Ill.). This procedure is very applicable to microtiter plate methods. The BCA is used for the same reasons the Lowry is used. Stoscheck (1990) has suggested that the BCA assay will replace the Lowry because it requires a single step, and the color reagent is stable under alkaline conditions.
Both a standard assay for concentrated proteins and a micro assay for dilute protein solutions are described below.
Principle
BCA reduces divalent copper ion to the monovalent ion under alkaline conditions, as is accomplished by the Folin reagent in the Lowry assay. The advantage of BCA is that the reagent is fairly stable under alkaline condition, and can be included in the copper solution to allow a one step procedure. A molybdenum/tungsten blue product is produced as with the Lowry.

11. Procedure Bradford Assay
Note: do all determinations in duplicate or triplicate
1. Pipette 0, 2, 4, 6, 10, 15 and 20  µl of BSA (1 mg/ml) into assigned wells of a 96-well plate.
2. Pipette up to 20 µl of unknown samples into individual wells of a 96-well plate.
3. Add 40 μl of Bradford Reagent into all wells containing standard or sample.
4. Add dd H 2O to all wells to bring the final volume to 200 µl.
5. Read absorbance at 595 nm without any prior incubation.
루틴하게 쓰이는 bradford 방법을 간단히 설명하겠습니다. 단백질의 농도를 구하기 위해 농도를 알고 있는 standard 단백질을 사용을 하는데 1mg/ml의 BSA를 각 양을 달리 하여 반응을 시킬 well에 넣고, 단백정량할려고 하는 시료도 well에 넣습니다. 그리고 bradford reagent를 넣고 H2O를 넣어 최종볼륨을 맞춘 후 별도의 incubation time 없이 595nm 파장에서 흡광도를 측정합니다. 흡광도와 BSA의 농도로 분산형 그래프를 그리고 그래프의 식을 구한 후 농도를 계산할 수 있습니다.

12. Protein A/G Agarose bead
Immunoprecipitation
Immunoprecipitation
Protein A/G Agarose bead
Specific Antibody
Discard the supernatant fraction
Cell
extracts →
A/G
Centrifuge
1000rpm, 3min
wash the beads 3-5 times
A/G
A/G
4℃,
4hr or O/N
Agitation
A/G
농도가 정해진 시료로 면역침강을 할 수 있습니다. 면역침강은 항체를 이용하여 원하는 단백질만을 분리하는 방법으로 단백질 상호작용 연구의 한 방법입니다. Cell extract에 분리하고자 하는 단백질의 특이적 항체와 항체를 특이적으로 결합하여 침전 시킬 수 있는 protein A 혹은 G agarose bead를 넣고 4도시에서 혼합해주면 IgG는 침전이 가능한 bead에 결합하고 항체는 단백질에 결합을 합니다. 이를 낮은 rpm에서 원심분리하면 결합하지 않은 단백질시료를 제거하고 bead에 결합하여 침전된 단백질만을 분리할 수 있습니다. 분리된 단백질은 SDS-PAGE와 Western 으로 detection 하여 단백질의 상호작용을 연구하는 한 방법입니다.
A/G
Resuspend the agarose/sepharose beads in 2 x sample buffer and mix gently.

13. Prepare protein A or G agarose/sepharose
Immunoprecipitation
Prepare cell lysate
Prepare protein A or G agarose/sepharose
Pre-clear the cell lysate by protein A or G agarose/sepharose bead
Determine the protein concentration of the cell lysate
면역 침강과정을 좀더 자세히 살펴보면, 면역침강 과정은 cell lysate 준비한 후 항체로 침전하기 전에 bead에 비특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 제거해주는 과정을 거쳐 면역 침강을 하게 된다. 1-4번까지과정을 거쳐 면역침강까지의 과정을 하나씩 설명하겠습니다.

14. 2. Prepare protein A or G agarose/sepharose
Immunoprecipitation
2. Prepare protein A or G agarose/sepharose
Wash the beads twice with PBS
Restore to a 50% slurry with PBS.
It is recommended to cut the tip off of the pipette tip when manipulating agarose beads to avoid disruption of the beads.
Protein A와 G는 IgG를 binding 시키는 단백질로 미생물의 surface protein으로 항체를 침전시키기위해 agarose bead에 코팅을 하였다고 이해하면 됩니다. 파우더의 경우 bead를 PBS로 2-3번 washing을 한 후 PBS에 50% slurry 로 만들어 사용합니다. Bead를 파이펫으로 취할경우 bead의 파괴를 막기위해 tip 끝을 잘라서 사용하도록 합니다.

15. 3. Pre-clear the cell lysate by protein A or G agarose/sepharose bead
Immunoprecipitation
3. Pre-clear the cell lysate by protein A or G agarose/sepharose bead
Pre-clear the cell lysate by adding 100 microliters of either protein A or G agarose/sepharose bead slurry (50%) per 1 ml of cell lysate and incubating at 4℃ for 10 minutes on a rocker or orbital shaker.
Remove the protein A or G beads by centrifugation at xg at 4℃ for 10 minutes. Transfer the supernatant to a fresh centrifuge tube.
agarose 나 sepharose에 단백질의 비특이적 결합을 줄이기 위해 cell lysate에 bead를 넣고 4도시에서 약 10분정도 agitation 한 후 원심분리하여 상등액만 회수합니다.
Pre-clearing the lysate will reduce non-specific binding of proteins to the agarose or sepharose when it is used later on in the assay.

16. Immunoprecipitation
4. Determine the protein concentration of the cell lysate (Bradford assay)
Dilute the cell lysate at least 1:10 before determining the protein concentration because of the interference of the detergents in the lysis buffer with the Coomassie-based reagent.
Dilute the cell lysate to approximately 1mg/ml total cell protein with PBS to reduce the concentration of the detergents in the buffer.
A more concentrated cell lysate (i.e., 10 mg/ml) may be necessary to immunoprecipitate a protein which is found in low levels in a cell model.
Pre clearing한 cell lysate를 단백량을 측정합니다. Cell lysis 과정에서 사용한 buffer에는 고농도의 detergent가 포함되어있으며, 고농도의 detergent는 bradford assay 반응을 억제할수 있기때문에 lyaste를 10분의 1로 희석하여 디터전트 농도를 낮춘후 단백질 양을 측정합니다.
면역침강을 위해 lysate는 총단백량을 1mg/ml로 희석합니다. 세포 내의 발현양이 적은 단백질을 IP할 경우 는 10mg/ml까지 사용하도록 합니다.

17. Procedure of Immunoprecipitation
Add the recommended volume of the immunoprecipitating antibody to 500 microliters of cell lysate.
Gently mix the cell lysate/antibody mixture for either 2 hours or overnight at 4℃ on a rocker or an orbital shaker.
Capture the immunocomplex by adding 100 microliters protein A or G agarose/sepharose bead slurry and gently rocking on either a rocker or orbital shaker for either 1 hour or overnight at 4℃.
Collect the agarose/sepharose beads by pulse centrifugation (5 seconds in the microcentrifuge at 14,000 rpm). Discard the supernatant fraction and wash the beads 3 times with 800 microliters ice-cold modified RIPA buffer.
Resuspend the beads in 2 x sample buffer
The agarose/sepharose beads are boiled for 5 minutes to dissociate the immunocomplexes from the beads.
위에서 준비된 lysate 에 항체와 bead를 넣어 4도시에서 4시간 혹은 O/N 한 후 원심분하여 immunocomplex를 회수합니다. Bead는 RIPA buffer 혹은 PBS로 washing 하고 SDS sample buffer 넣고 끓인 후 전기영동합니다.
2; A 2 hour incubation time is recommended for the immunoprecipitation of active enzymes for kinase or phosphatase assays.
3; In many instances, immunocomplex capture can be enhanced by adding 2 micrograms of a bridging antibody (e.g., rabbit-anti-mouse IgG). This is especially important with antibodies that bind poorly to protein A such as mouse IgG1 or antibodies generated in chicken.
4,Occasionally, washing with modified RIPA buffer will strip the immunocomplex from the agarose/sepharose beads. In these cases, washing with the milder PBS is recommended.
7, The beads are collected by centrifugation and SDS-PAGE is performed with the supernatant fraction. Alternatively, the supernatant fraction can be transferred to a fresh microcentrifuge tube and stored frozen at -20좧 for later use.  Frozen supernatant fractions should be reboiled for 5 minutes directly prior to loading on a gel.

18. Immunoprecipitation
Table 1. Relative Affinity of Immobilized Protein A and Protein G for Various Antibody Species and Subclasses of Polyclonal and Monoclonal IgG’s.
면역침강에서 사용한 bead는 Potein A 와 G가 있었습니다. A와 G는 IgG에 결합하는 단백질로 IgG의 species와 subclass 에 따라 그 affinity 에 차이가 있습니다. ㅁA는 IgG의 Fc에 결합하고 G는 Fc와 Fab에 결합을 하기때문에 면역침강에 사용하려고하는 항체의 species와 subclass 를 확인한후 protein A와 G를 선택하면 됩니다.
Protein G is a cell surface-associated protein from Streptococcus that binds to IgG with high affinity
Protein A: Fc portion of IgG
Protein G : Fab and Fc portion of IgG

19. SDS-PAGE &Western Blot
Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylaminde Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Gel: a cross-linked matrix
Western Blot
Western blot analysis can detect one protein in a mixture of any number of proteins while giving you information about the size of the protein.
끝으로 SDS-PAGE와 Western blot 과정을 살펴보겠습니다.
SDS는 sodium dodecy sulfate로 detergent의 하나입니다. PAGE는 Polyacrylaminde Gel Electrophoresis 입니다. Western blot은 항체를 이용하여 단백직 mixture 중에서 한 단백질만을 detection하는 방법입니다.

20. SDS-PAGE
단백질을 전기영동하기 전에 SDS buffer로 단백질을 끓여줘야하데.. 단백질은 자연상태에서 전하가 –이거나 +로 존재하므로 SDS로 단백질을 denature 시켜 단백질을 모두 –전하가 되게하여 전류에 의해 이동을 가능하게 합니다. Single subunit의 protein은 SDS에 의해 denature 되고 –전하를 갖게 되며 two subunit protein의 disulfide 결합은 mercaptoethanol을 처리하여 환원시켜고 SDS로 denature 시킴니다. SDS sample buffer로 끓인 단백질을 polyacrylamide gel에 전기영동을 하면 단백질은 크기순서대로 분리가 되고 분자량이 작은 단백질이 빨리 이동하고 분자량이 큰 단백질은 느리게 이동하여 band를 형성하게 됩니다.

21. Western Blot
Western blot은 polyacrylamide gel에 전기영동된 단백질을 membrane에 transfer 한 후 항체를 이용하여 단백질을 detection 하는 과정입니다.
Membrane에 transfer시킨 후 not fat milk로 membrane 전체를 blocking 하고 1차 항체를 붙인 후 enzyme에 conjugation 된 2차 항체를 결합시키고 기질을 처리하여 발산되는 빛을 detection enzyme에 만들어 membrane에 침착시키는 것을 detection 하면 됩니다.

22. Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane
Choice of Membrane
Nitro Cellulose (NC)
Choose By Detection Systems : Radiolabeled, Cromogenic and Chemiluminescent Detection Systems
Choose By Procedures : Westerns, Protein & Immunoblotting, Northerns, Southerns
Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane
Benefits : Hydrophobic PVDF membrane is designed for protein sequencing,
Choose By Detection Systems : Chemical compatibility allows the use of all commonly used stains
Choose By Procedures : Western, Transfers, Protein Sequencing, Amino Acid Analysis
전기영동 후 사용되는 membrane에는 NC와 PVDF가 있습니다. 목적에 맞게 사용사시면되고 western에는 두가지 다 사용이 가능합니다.

23. Western blot detection methods
Chemiluminescent: Alkaline phosphatase (AP), Horseradish peroxidase (HRP)
Bioluminescent: luciferin-base derivative,PVDF
Chemifluorescent: Fluorogenic compound
Fluorescent: FITC, Texas Red, rhodamine
Autoradiography: Rodioactivity
Colorimetic
AP: 2-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/Nitroblue Tetrzolium (BCIP/NBT)
HRP: 4-chloro-1-naphthol (4CN)
Densitometer
여러 가지의 Western blot detection 방법들이 있지만 주로 1번방법과 6번 방법을 사용합니다.1번 방법은 항체에 결합한 효소가 chemiluminescent 기질을 산화 시키면 exited-state 생성물이 만들어지고, emission 되어 빛이 나타나게 되면 이 signal은 X-ray film롸 CCD로 확인이 가능하다.
6번의 방법은 기질이 2차 항체에 결합되어 있는 효소와 반응하여 색깔을 띠는 침전물을 만들어서 membrane에서 눈으로 직접 확인이 가능하다.
AP의 기질은 BCIP/NBT이며 HRP의 기질은 4CN입니다.

24. Table 2. Comparison of western blot detection methods
Lumine-scent (Chemi- and Bio-)
Chemifluorescent
Fluoros-cent
Rad-ioisotopic
Colorime-tric
Sensitivity
Excellent
Very good
Economy of antibody use
Good
Speed of detection
Poor
Ease of reprobing
Fair
Ease of quantitation
Durability of results

25. The End