1. BIOTECNOLOGIE Le BIOTECNOLOGIE, quelle più recenti, nate dall’incontro della genetica con la biologia molecolare, consistono in una serie di tecniche utilizzate per produrre sostanze specifiche da organismi viventi o da loro derivati. Il fine è produrre beni utili all’uomo:  in allevamento e in agricoltura per produrre animali e piante transgeniche;  applicazione del DNA ricombinante per fini medici, curativi o preventivi (produzione di farmaci, vaccini, terapia genica);  diagnostica;  analisi della funzione dei geni, attraverso la clonazione genica;  mappatura del genoma (sequenziamento del genoma umano);  ricerca forense (indicazioni sul colpevole, test paternità);  tutela ambientale (biorisanamento).

3. Trasduzione

5. La tecnica del DNA ricombinante è alla base delle moderne biotecnologie (esperimento Cohen- Boyer1973). (esperimento Cohen- Boyer1973). Con il termine DNA ricombinante si indica una molecola di DNA modificata, in cui sono inseriti frammenti di DNA provenienti da due o più organismi diversi.frammenti di DNA  si possono ottenere frammenti di DNA di piccole dimensioni da modificare e analizzare;  si possono produrre grandi quantità di questi frammenti;  si può conoscere la sequenza di questi frammenti;  si possono produrre proteine in grandi quantità; Il DNA ricombinante

7. Questi Enzimi speciali sono detti di restrizione : tagliano entrambi i filamenti di DNA in corrispondenza di specifiche sequenze nucleotidiche palindrome, lunghe 4-8 paia di basi e dette siti di restrizione. Gli enzimi di restrizione per ottenere frammenti di DNA Quando un batterio viene infettato da un virus (batteriofago), produce degli enzimi speciali che tagliano il DNA virale, rompendo i legami fosfodiesterici tra due nucleotidi adiacenti.

8. Le estremità di taglio possono essere piatte (blunt ends) (o coesive (sticky ends). Tali enzimi permettono di isolare un frammento di DNA compreso tra due sequenze di taglio, per esempio un gene, dal resto della molecola di DNA, per inserirlo con l’aiuto dell’enzima DNA-ligasi in una molecola di DNA ricevente. Si creano così molecole di DNA ricombinante.

9. Esempi di enzimi di restrizione

10. L’elettroforesi su gel L’elettroforesi su gel (di agarosio o poliacrilammide) permette di separare frammenti di DNA di dimensioni diverse sfruttando la carica negativa delle molecole di DNA (gruppi fosfato).

11. Per trasferire un frammento di DNA da un organismo all’altro o per ottenere più copie del frammento d’interesse (CLONAZIONE) si utilizzano molecole di DNA vettore: 1. Plasmidi vettori; 2. Virus fagi; 3. Agrobacterium tumefaciens I vettori devono soddisfare alcuni requisiti: - replicarsi in modo indipendente nella cellula ospite - dimensioni tali da poter essere manipolati - presentare marcatori genetici per rilevarne la presenza (esempio geni per la resistenza agli antibiotici) -presentare una o più sequenze per il riconoscimento con enzimi di restrizione CLONARE FRAMMENTI DI DNA

12. Plasmidi I batteri contengono plasmidi, piccole molecole di DNA circolare e a doppio filamento con due o pochi geni, che si duplicano in modo autonomo (possiedono un’origine di duplicazione) e conferiscono ai batteri vantaggi selettivi. Si conoscono plasmidi: 1. degradativi, per metabolizzare sostanze tossiche; 2. col, codificano per le colicine, che uccidono altri batteri; 3. della virulenza, trasformano l’ospite in patogeno; 4. F, consentono lo scambio di materiale genetico; 5. R, contengono geni che conferiscono resistenza a determinati antibiotici poiché codificano per enzimi che degradano il farmaco o ne riducono gli effetti, tali geni possono essere trasferiti dal plasmide R al cromosoma batterico, a virus e a batteri di altre specie compresi patogeni umani

13. 13 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 Uso dei plasmidi plasmide pSC101

14. I plasmidi che hanno incorporato il gene esogeno possono essere inseriti in cellule batteriche e duplicarsi insieme ad esse, producendo molte copie del gene clonato. Alcuni plasmidi possono anche permettere l’espressione del gene e produrre quindi proteine in elevate quantità (Es.: produzione di insulina, vaccino per il virus dell’epatite B).

15. 15 Sadava et al. Biologia.blu © Zanichelli editore, 2012 I vettori di espressione

16. La produzione dell’insulina Il primo farmaco ricombinante introdotto in commercio fu l’insulina, ottenuta nel 1978 e approvata nel 1982. Prima di allora l’insulina veniva purificata dal pancreas di maiali (o bovini) con una complessa procedura e con il rischio di essere resa inefficace dal sistema immunitario del paziente che lo riconosceva come estraneo. Oggi il gene per l’insulina umana è stato clonato e fatto esprimere in batteri in modo da ottenere grandi quantità di ormone in forma pura. Oltre all’insulina è possibile produrre: l’ormone della crescita e altri ormoni come le gonadotropine, fattori per la coagulazione per la cura dell’emofilia, anticorpi, vaccini.

18. Il vaccino contro l’epatite B L’antigene di superficie del virus viene prodotto da un lievito, Saccharomyces cerevisiae, e purificato ed iniettata.

19. Precedentemente i vaccini prodotti potevano essere : INATTIVI cioè con virus uccisi trattati con appositi agenti inattivanti (ad esempio il calore ). L’immunità indotta dai vaccini inattivati non è duratura e sono pertanto necessari frequenti richiami. Sono inoltre rischiosi poiché possono contenere virus più resistenti al trattamento inattivante come era accaduto nelle prime partite del vaccino antipolimelitico ucciso (tipo Salk). ATTENUATI cioè con virus mutanti vivi ma con ridotta patogenicità in modo da stabilire una sintomatologia attenuata ma capace di indurre una risposta immunitaria simile a quella prodotta dall’infezione naturale (esempio vaccino antipoliomelitico tipo Sabin). La protezione conferita è di lunga duratura (anche per tutta la vita) ma con il rischio di una riattivazione del virus o di un mancato attecchimento nel soggetto vaccinato.

20. I farmaci biotecnologici usati in medicina prodottouso Fattore della stimolazioneStimola produzione di leucociti in pazienti affetti da cancro o AIDS eritropoietinaPreviene l’anemia in pazienti sottoposti a dialisi renale e terapia tumorale Fattore XIII della coagulazionePermette la coagulazione in pazienti emofiliaci Ormone della crescitaSostituisce l’ormone naturale in soggetti con crescita ridotta Attivatore tissutale del plasminogeno dissolve i coaguli ematici dopo infarto del miocardio o ictus Vaccini epatite B, HSV, influenza, meningite, pertosse Prevenzione e trattamento delle malattie infettive. Fattore di crescita derivato dalle piastrine Stimola guarigione dalle ferite

21. Anche i virus possono funzionare da vettori poiché penetrano facilmente nelle cellule batteriche e si moltiplicano velocemente al loro interno. Ne è un esempio il fago lambda. Il virus possiede una molecola di DNA lineare che presenta alle estremità due sequenze coesive lunghe 12 nucleotidi, chiamate regioni COS. Quando il fago infetta il batterio E.coli queste sequenze si attaccano tra loro ed il DNA assume una forma circolare. Un enzima prodotto dal virus taglia il DNA virale e quello batterico in specifiche regioni e permette l’integrazione del DNA virale in quello di E.coli.

22. Con l’ingegneria genetica si può modificare il corredo genetico delle piante. Le piante sono prodotte da cellule nel cui DNA è stato inserito un gene esogeno per far acquisire loro caratteristiche che non possedevano originariamente. Piante transgeniche

23. Piante ad elevato contenuto nutrizionale La vitamina A, importante per il metabolismo e per la crescita cellulare è presente in alimenti come carote, uova e burro. Il riso invece, cereale alla base dell’alimentazione asiatica, ne è povero. Di conseguenza in India in Estremo Oriente la popolazione soffre di carenza di vitamina A e ciò porta a 2 milioni circa di decessi all’anno, soprattutto nell’età infantile. Per questo alcuni ricercatori svizzeri nel 200 hanno realizzato un riso transgenico Golden Rise (dal colore giallo intenso) contenente due geni per la sintesi di vitamina A. I geni provenivano dal mais e dal batterio Erwinia uredovora. La coltivazione è iniziata nelle Filippine nel 2008 anche se la sua commercializzazione è finora bloccata.

24. All’Università del Winsconsin è stata sviluppata una barbabietola ad alto contenuto di acido folico, una vitamina la cui carenza provoca una forte anemia. La lista dei prodotti frutto del connubio tra scienza e agricoltura è lunghissima: pomodori arricchiti con betacarotene (centro di ricerche di Belteville), granturco e broccoletti pieni di vitamine A ed E (Università dell’Illinois), il caffè geneticamente decaffeinato (Università delle Hawaii) Molti laboratori, compreso quelli dell’Alfred Hospital di Melbourne, in Australia, stanno studiando anche la possibilità di somministrare vaccini attraverso i cibi come la banana anticolera o l’insalata addizionata con il vaccino per l’epatite B o il morbillo. …saranno i primi alimenti da acquistare con ricetta medica?

25. Piante transgeniche resistenti ai parassiti Sono piante resistenti ai parassiti. Un batterio il Bacillus thuringensis presente nel suolo, possiede un gene che produce una proteina tossica per molti insetti parassiti. La proteina si lega alle cellule intestinali degli insetti e ne compromette la funzione così che l’insetto non riesce più a nutrirsi e muore. La tossina è specifica per le larve d’insetto ed è innocua per i vertebrati o per gli insetti benefici come le api. Il gene è stato inserito in molte piante di interesse agricolo come mais, cotone e riso, che sono quindi resistenti a molti parassiti e sono chiamate piante Bt.

26. Piante (mais, colza e soia) per la resistenza ad erbicidi Anche in questo caso si tratta di geni di origine batterica che producono sostanze capaci di inattivare erbicidi (come il glifosfato, il glufosinato, il bromoxinolo) gli erbicidi usati contro le piante infestanti non sono molto selettivi e possono danneggiare anche il raccolto poichè agiscono su processi fisiologici come la fotosintesi o la sintesi di amminoacidi. Rendere le piante coltivate resistenti le fa sopravvivere anche a quantità elevate di erbicidi.

27. Sono stati creati batteri geneticamente modificati in grado di rimuovere i metalli pesanti (mercurio, piombo o cadmio) rilasciati dagli scarichi industriali che spesso contaminano le falde acquifere e difficili da eliminare. Ai batteri (Escherichia coli) è stato aggiunto un gene capace di legare il mercurio intrappolandolo all’interno della membrana cellulare. I batteri possono poi essere immobilizzati su un supporto solido per creare biofiltri. Biorisanamento Si possono utilizzare microrganismi per rimuovere sostanze inquinanti dall’ambiente. Il 24 marzo 1989 la petroliera Exxon Valdez naufragò in prossimità delle coste dell’Alaska, riversando in mare 40000 m 3 di petrolio che contaminarono l’area costiera per 1500Km. Siusarono dei fertilizzanti per aumentare la proliferazione di microrganismi presenti naturalmente nell’ambiente capaci di degradare molti composti organici inquinanti presenti nel petrolio. L’area venne bonificata in tre anni.

28. Nel 1983 Kary Mullis vince il premio Nobel per aver sviluppato la tecnica della PCR. La PCR: reazione a catena della polimerasi

29. 29 Sadava et al. Biologia.blu © Zanichelli editore, 2012 Dopo aver clonato il DNA ricombinante nelle cellule transgeniche, queste colture cellulari diventano degli archivi (genoteche) di informazioni genetiche. Le genoteche di frammenti di DNA

30. Come trovare il gene che ci interessa fra tutte le colonie? Per individuare quali colonie contengono il gene di interesse possiamo utilizzare una sonda a DNA cioè un frammento di pochi nucleotidi complementari ad un tratto del gene d’interesse. 1. Si stende sulle colonie un filtro di nitrocellulosa o di nylon

31. 2. Le cellule assorbite dal filtro vengono distrutte (lisi) e il DNA liberato sottoposto a denaturazione. 3. Il filtro viene bagnato con una soluzione contenente la sonda specifica. La sonda è marcata con 32 P ( i suoi nucleotidi contengono cioè l’isotopo radioattivo del P).

32. Dopo un lavaggio, sul filtro restano solo le sonde geniche che si sono appaiate al DNA del gene cercato (ibridazione ). Si sovrappone al filtro una pellicola sensibile ai raggi X. La pellicola sarà impressionata in corrispondenza delle aree in cui si sono concentrate le sonde geniche marcate con l’isotopo radioattivo (autoradiografia ). Il confronto tra le aree della pellicola impressionate e la piastra Petri di origine permette di localizzare le colonie contenenti il frammento di DNA bersaglio

34. Dolly, animale copertina 5 luglio 1996, in una fattoria della cittadina di Roslin,vicino ad Edimburgo, nasce Dolly, il primo mammifero clonato che ha tre madri e nemmeno un padre. razza Finn Dorset razza Blackface razza Finn Dorset razza Blackface

35. La clonazione riproduttiva L’ embryo splitting permette di ottenere animali identici suddividendo un unico embrione, quindi riproducendo quello che avviene durante la formazione di gemelli identici. Ricercatori dell’Università dell’Oregon a Portland hanno suddiviso un embrione di scimmia (Macacus rhesus) di 8 cellule in 4 parti che hanno impiantato nell’utero di altrettante scimmie: una sola ha portato a termine la gravidanza

37. Il metodo si basa sulla capacità della DNA pol di copiare un filamento di DNA stampo. Per il sequenziamento sono necessari: -Il filamento di DNA stampo (di cui si vuole conoscere la sequenza); -primer di innesco per la DNA polimerasi; -la DNA polimerasi; -miscela di 4 nucleotidi (dNTP); -4 nucleotidi modificati (ddNTP quando sono incorporati nella catena di DNA nascente non possono legare un nucleotide successivo ed interrompono la duplicazione) sono fluorescenti

38. 38 Sadava et al. Biologia.blu © Zanichelli editore, 2012 Come si fa a sequenziare il DNA?

39. Il Progetto Genoma Umano (o HGP dall’inglese Human Genome Project) è stato uno dei più grandi progetti di ricerca in campo biologico dell’intero Novecento. È stato completato ufficialmente nel 2003. Il progetto ha visto la collaborazione di un ente pubblico statunitense, i National Institutes of Health (NIH), e di un’azienda privata, la Celera Corporation L’obiettivo era ottenere la sequenza completa del corredo cromosomico aploide di un essere umano, oltre 3 miliardi di nucleotidi. Poiché ogni genoma è unico, il Progetto ha previsto la comparazione di diversi campioni con un’elaborazione statistica dei dati. L’esame delle sequenze ha rivelato alcuni dati di estremo interesse. Il più sorprendente è che il nostro genoma contiene dai 28000 ai 30000 geni, contro i circa 100000 che i genetisti ritenevano plausibili in precedenza.

40. Risulta che la maggior parte del DNA umano è costituito da sequenze che non vengono mai tradotte in polipeptidi, junk DNA («DNA spazzatura»). I ricercatori stanno iniziando a chiarire la vera natura di questa componente: telomeri e centromeri introni, attraverso il meccanismo di splicing e in particolare attraverso lo splicing alternativo, garantiscono al DNA eucariotico versatilità sequenze coinvolte nella regolazione dell’espressione genica pseudogeni, antichi geni che hanno perso funzionalità in seguito a mutazioni. Molti biologi ritengono che la loro presenza possa favorire, per mutazione, la comparsa di nuovi geni in una specie. Vi sono inoltre rari casi di pseudogeni che hanno riacquistato la funzione perduta attraverso una successiva mutazione. trasposoni, elementi in grado di moltiplicarsi e spostarsi nel DNA all’interno del cromosoma o da un cromosoma ad un altro. A tutt’oggi nessuna funzione utile è stata scoperta per questi elementi, che, anzi, possono essere coinvolti nell’insorgenza di tumori. sequenze ripetute, alcuni studiosi ritengono che tali sequenze siano importanti per dare compattezza al DNA, e recenti ricerche hanno anche fatto emergere un loro ruolo nel processo di regolazione della trascrizione.

41. Applicazioni La creazione di una banca dati con lo scopo di identificare ogni persona attraverso il proprio genotipo per agevolare le indagini della polizia Effettuare screening del DNA per studiare geni anomali Esecuzione di screening prenatali per correggere malattie genetiche fin dai primi mesi di vita Creare farmaci compatibili con il DNA dl paziente per evitare allergie Diagnosi prenatale nella fecondazione assistita Conoscenza e cura delle malattie

42. La terapia genica Lo scopo della terapia genica è correggere i difetti del genoma che sono alla base delle malattie genetiche: Il silenziamento dei geni in tessuti malati (offre la possibilità di applicazione contro tumori o contro malattie degenerative); cellule malate potrebbero essere prelevate modificate geneticamente ed essere reimpiantate (esempio SCID Severe Combined Immuno Deficiencies), anche le cellule embrionali potrebbero essere modificate geneticamente e reimpiantate. Il vettore virale infetta le cellule ed inserisce al loro interno la copia del gene sano

43. ADA- SCID sindrome da immunodeficienza combinata grave Rara malattia genetica causata dalla produzione dell’enzima adenosina deaminasi difettoso che il sistema immunitario è gravemente compromesso, al punto che l’organismo è incapace di difendersi dagli agenti infettivi, persino da infezioni comuni come il raffreddore o la varicella. In passato questi bambini erano costretti a vivere isolati e in ambienti con aria filtrata per sopravvivere (da qui la definizione di "bambini bolla"). L'unico trattamento curativo era il trapianto di midollo osseo, effettuabile in presenza di un donatore compatibile. In alternativa, si può fornire al bambino l'enzima ADA purificato, di origine bovina, somministrato con iniezioni intramuscolari periodiche: non sempre, però, questa terapia è efficace o disponibile. Nel 1990 negli Stati Uniti una bimba di 4 anni è stata sottoposta con successo alla terapia genica. Il protocollo terapeutico prevede il prelievo delle cellule staminali dal midollo osseo dei pazienti, la loro correzione in laboratorio tramite l'introduzione del vettore contenente il gene terapeutico e infine la reinfusione tramite un vettore virale nell'organismo del paziente. Oggi il protocollo è disponibile anche in Italia e probabilmente la terapia genica per l'ADA-SCID potrà diventare un farmaco a tutti gli effetti ed essere così fruibile da pazienti di tutto il mondo.

44. sequenziamento