1. Separation Basics UHPLC_LC MSMS & Column Technology
Bene Technology Co., Ltd.
MKT

2. 내용 1. HPLC 의 역사 2. HPLC 의 구조, Terminology 3. 컬럼 의 분리 단, 구조 4. 분리모드
5. Reversed Phase Column선택하는 법
6. 분석방법 조정 가이드
Appendix

3. 1. HPLC 의 역사
; Mikhail Tswett Separates Plant Pigments on Chalk Columns
1970년 이전 ; few reliable chromatographic methods
1970’년대
; open-column chromatography, paper chromatography, and thin-layer
chromatography => similar compounds
pressure liquid chromatography => flowthrough/purification times by column
chromatogaphy. Pump Technology (constant flow rate or constant pressure)
1970년대 중반 : High pressure liquid chromatography, column packing materials and
the on-line detectors => Performance
I970년대 후반 reverse phase liquid chromatography => very similar compounds.
1980년대 이후 ; 대부분의 chemical compounds 분리. New techniques=> Computers and automation, typical column(250 mm L, 3-5 mm ID) => micro/capillary columns(1-2mm ID, 3 µm-300 µm ID), affinity/chiral columns and Fast HPLC(Length 3-5mm, smaller particles size10, 5, 3um), optimal analysis ; various types of columns, a variety of detectors of the compound.
2000년대 ; GLP, UHPLC(Sub 2um), MSMS,… Quantitaton/Qualification,… Prep,…
응용영역 : biotechnological, biomedical, biochemical research, pharmaceutical industry, cosmetics, energy, food, and environmental industries,…

4. 2. HPLC 구조 Conventional LC HT LC : UPLC, RRLC, … Scale ?
Speed Separation
Sensitivity
Reproducibility …
Mass Spec
UV/Vis
Detector
LP Gradient
Pump
Column
ELS
Manual/Auto
Injector
Fluores.
Conventional LC
HT LC : UPLC, RRLC, …

5. HPLC Terminology
용매 =>펌프 =>시료주입기 =>컬럼 =>검출기 >Data System
LC/LCMS용
수용성 용매
지용성 용매
휘/비 Buffer
Filter
Degassing
Isocratic
HP/LP G . 유속 압력
Run Time
수용성 용매
지용성 용매
Buffer
Filter
시료주입량
Injection Start
Separation
Reversed P
Normal P
IE, SEC,…
Mixed
Chiral,…
Preheat /cool
Chromatogram
Quan/Qual
Purity
RI, UV/Vis
Fluo., PAD ELSD,…
MS ; MRM/SRM
DDA,…
FTIR, NMR,…
Automation
Validation
IQ/OQ/PQ
Traceable
유로(시스템/Tubing/컬럼)
; 내경, 길이, Void Volume, Equilibrium Time, Injection Volume,…
Teflon, SUS316, In-line filter, HDPE, Quarz,…
Nut Ferrule, Hand-tight fitting,…
* Compound Specific Information : m/z,…

6. 3. 컬럼의 분리 단 분배계수 KA = [A]u phase/[A]l phase
KA = [A]sol phase/[A]lliq phase

7. Column의 구조의 활용 Vt = Vo + Ve Tubing Frit 분리관 Vt는
GPC/GFC의 경우 V의 약 75-80%
HPLC의 경우 V의 약 60-65%
안정화 부피 : Vt 의 10-20배 이상
시료 주입량 : Vt 의 % 이하
시료 농도 : 시료 주입량의 0.I -10% 이하
충전물

8. Totally Porous, Superficially Porous, Surface Porous
Column 충전물의 구조
Porous Beads
Non-Porous Beads
Totally Porous, Superficially Porous, Surface Porous

9. Column 충전물의 Surface의 특징
Silica Surface(NPC)
Area m2/g
Chemistry
Si-OH’s
Bonding
RPC
Pore
Size
분포도
Particle
분자량
/Hydrodynamic Volume
분리 능
Silica는 일반적으로 pH 에서 사용하고 Bonding에 의해서 pH 1-11 까지 가능함
pore size A은 4-10K 이하, A은 K이하 분리함

10. 4. 분리모드 1 ; A, B, C term 이해 A. Eddy Diffusion : 경로차
B. Longitudinal Diffusion
: 확산
C. Mass Transfer
: Pore Surface Interaction
Lateral Diffusion

11. Van Deemter Plot

12. 분리모드 2 ; 그림으로 보는 분리 Steric Interaction
Adsorption Interaction: 컬럼 내/외 Surface
Injection Vo VE VR
Log M
Retention Time
GPC/GFC
Steric(Entropic) Interaction
HPLC(RPC, NPC, IEX,..)
Adsorption(Energetic) Interaction
Adsorption

13. 분리모드 3 ; Resolution TR1 TR2 K0 , T0 Theoretical Plate Selectivity
Retention Factor
K0 , T0
Time
Response
TR1
TR2

14. K’ : Capacity Factor /Correct Mobile Phase Strength
수식으로 보는 분리 : Resolution
R > : Baseline Resolution
K’ : Capacity Factor /Correct Mobile Phase Strength
α : Selectivity Factor /Right Chemistry
N : Efficiency Factor /Correct Column Dimension

15. A.1 Capacity/Retention FactorK R ∝ ↑
2<K<10
K’=(Ta-T0)/T0
Mobile Phase Strength ↓ K’ ↑ => R↑
RPC, NPC, IEX, …

16. Mobile/Stationary Phase (C18, C8, C4) Strength

17. ∝ α > 1.2 α=KA’/KB’ How to Interact with compound A.2 Selectivity
- Stationary/Mobile Phase
- pH
- Temperature
- Additives

18. Chemical Selectivity : C18 end capping process
TMS => - CH3
Batch Synthesis
Flow Synthesis/Microreactor
: Tri step end-capping

19. Anthocyanin/Anthocyanidin

20. ∝ 5000<N<25000 A.3 Efficiency/Speed Clength ↑ N ↑ Dparticle↓ N ↑
Minimize Extra Column Volume
Mixing Performance
Optimum Velocity(Flow Rate)

21. Column의 분리 능 vs 선 속도 : Van Deemter Plot
Downscale

22. Column Dimension Downscale : N/Res.
Peptide Mapping

23. Small Particle or Large Particle의 특성
HETP
선 속도
5um
2um TR N
5um
2um
HETP vs u
TR vs N
Column Permeability
Large Peak Capacity => Large Particle Size
Very Fast Separation => Small Particle Size

24. 5. Reversed Phase Column 선택 하는 법 1

25. Reversed Phase Column 선택 하는 법 2

26. Polar, Mid to Non polar Compounds

27. Polar Compounds

28. Basic Compounds

29. Reversed Phase Column 선택 하는 법 3 : SRM 870

30. 6. 분석 방법 조정가이드 ; USP & FDA Parameter Max Spec 컬럼 길이 ±70% 컬럼 ID
컬럼 선 속도 유지 유속
±50%
주입량
최대한 적게
감도/재현성 유지
Particle Size
To 50%
* 주요 관공서의 표준방법을 수정할 경우 기존분석법과 수정방법을 동시에 수행하여 정확성, 재현성등 검증조건에 영향을 주지 않아야 합니다.

31. a. 조정 시 Validation 고려사항 정확성 정밀성 Selectivity/Specificity 직선성 Range
Ruggedness
Repeatability
Reproducibility
Robustness
Selectivity/Specificity
직선성
Range
LOQ : S/N >10
LOD : S/N > 3
System Suitability Guide
Resolution > 2
USP Tf < 2
Repeatability Area, Tf
Retention Range 2<K>10
Relative Retention RR>1.2
S/N >10

32. b. Isocratic Separation 고려사항
현재 방법 성능
Resolution
USP Tf
Repeatability
S/N ratios
기기 조건
Void Volume : Mixing/Tubing/Cell Volume
Data Rate
Cell Path Length
System Pressure
3. 분석조건
컬럼 : Length/Internal Diameter/Particle Size/온도 유속
이동상점도
주입량
시료용매/농도
Backpressure

33. c. Isocratic/Gradient Separation 고려사항
Isocratic Separation
Sample Load
: Vt 의 0.5-1% 이하,
농도 1% 이하
Sample 용매 강도 고려
System Void Volume
: Mixing/Tubing/Cell Volume
Injection 정밀성
: Vinj 변화
Data Rate
: Points/Peak
Gradient Separation
Isocratic +
Delay Volume
: Backpressure변화
Gradient Time : K*
Gradient Delay Time
: Gradient Volume/Column Volume Ratio 유지
Post Run Equilibration Time
: Delay Volume x 5 이상

34. Appendix 1. SRM 870 Uracil : Void volume marker
Quinizarin : Activity toward chelating reagent
Toluene : Hydrophobic Retention
Amitriptyline : activity toward bases
Ethylbenzene : Methylene Selectivity

35. Reversed Phase Column Chemistry 이해

36. Reversed Phase Column Chemistry 이해

37. Appendix 2. DAC Column/YMC Prep LC

38. Prep Process