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第一节 DNA 的重组 DNA Recombination
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DNA 重组包括: 同源重组 细菌的基因转移与重组 位点特异重组 转座重组 接合作用 转化作用 转导作用
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发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination) ,又称基本重组。 是最基本的 DNA 重组方式,通过链的断裂和 再连接,在两个 DNA 分子同源序列间进行单 链或双链片段的交换。 以 E.coli 的同源重组为例,了解同源 重组机制的 Holliday 模型。 一、同源重组
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受体
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四、转座重组 由插入序列和转座子介导的基因移 位或重排称为转座( transposition )。
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第二节 重组 DNA 技术 DNA Recombination Technique
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基因工程诞生的历史背景: 1973 年是基因工程诞生的元年。 1. 1944 年 Oswald T.Avery 等的肺炎球菌转化证明 了 DNA 是遗传信息携带者。 2. 1953 年 James Watson 和 Francis Crick 两人提出 了 DNA 结构的双螺旋模型,揭示了遗传物质自我复 制的机制。 3. 1961-1965 年, 科学家破译了生物界全部 64 个遗 传密码, 发表了划时代的遗传密码字典,提出了遗 传信息由 DNA→RNA→ 蛋白质传递的中心法则。 4. 1970 年发现了反转录酶,丰富了中心法则,为 cDNA 的制备奠定了基础。
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5. 染色体外 DNA---- 质粒的深入研究,为第一批 重组 DNA 载体提供了材料。 6. 1968-1970 年,限制性内切酶的发现和纯化, 为 DNA 的体外重组提供了有力的工具。 7. 1972 年, Berg.D 等人首次用限制性内切酶 EcoRI 切割噬菌体和 SV40 病毒 DNA 分子,将这两 种不同来源的 DNA 片段成功地在体外连接成杂合 DNA 分子。 至此,用重组 DNA 技术改变生物学性状的尝试 在 1973 年由 Cohen 等人完成。从此,这项技术为 生物学带来了一场深刻的革命,这类技术本身也 迅速地发展起来,并广泛地渗透到各个学科的研 究领域。
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一、重组 DNA 技术相关概念 (一) DNA 克隆 克隆( clone ) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化 ( cloning ), 即 无性繁殖。
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技术水平: 分子克隆( molecular clone ) 即 DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆(动物或植物)
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内切核酸酶
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,维持细菌遗传性状的稳定。
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限制性内切核酸酶或 DNA 结合蛋白所 特异识别、结合的 DNA 位点的核苷酸序列, 呈二元旋转对称,通常将这种特殊的结构 顺序称为回文结构( palindrome )。 识别序列可以是四核苷酸、六核苷酸或 八核苷酸;产生的切口可以是粘性末端、 平头或钝性末端、配伍末端。 。 5’5’ 5’5’ 3’3’ 3’3’
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5’5’ 5’5’ 5’5’ 5’5’ 5’5’ 5’5’ 5’5’ 5’5’ 3’3’ 3’3’ 3’3’ 3’3’ 3’3’ 3’3’ 3’3’ 3’3’
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( 三 ) 目的基因 目的基因:用来扩增作研究或生产某一 种蛋白质的基因。就是在重组 DNA 时,人 们感兴趣的基因或 DNA 序列,又称目的 DNA(target DNA) 。 类型: cDNA(complementary DNA) :指经反转 录合成的、与 RNA 互补的单链 DNA ,经聚 合可合成双链 cDNA 。 基因组 DNA(genetic DNA) :指代表一个 细胞或生物体整套遗传信息 ( 染色体及线粒 体 ) 的所有 DNA 序列。
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大容量载体 柯斯质粒载体 酵母人工染色体载体
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感受态细胞:指具备接受外源 DNA 能力的宿主细胞
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(六)克隆基因的表达 表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 1、原核表达体系 2、真核表达体系
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第三节 重组DNA技术与医学 的关系 (一)疾病基因的发现与克隆 (二)生物制药
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(五)遗传病的预防 1、产前诊断 2、携带者测试 3、症候前诊断 4、遗传病易感性预测
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