1. 식중독균 PFGE 검사법
광주지방식약청
유해물질분석과 유명상

2. Contents PFGE란? PFGE 도입 배경 PFGE 검사 원리 I~III PFGE 검사 과정 I~VI

3. PFGE란 ? PFGE: Pulsed-Field Gel Electrophoresis
식중독균의 근원과 식중독 사이의 유연관계 확인은 식중독 예방에 필수적인 기초자료 얻을 수 있음
1980년대 이후 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), Ribotyping, PCR-based subtyping 등이 많이 이용
1984년 Schwartz, Cantor는 PFGE를 DNA를 분리하는 새로운 방법으로 기술, 30 kb~ 10Mb 이상의 크기까지 분리
최근 PFGE는 식중균의 subtyping 에 적용되어, 활용되고 있으며, PFGE에 생기는 DNA restriction pattern은 실험실내, 실험실간 안정적인 특징이 있음

4. PFGE 도입 배경
효율적인 식중독 예방을 위하여 식중독 발생시 원인 추적 및 확산방지를 위해 식품에서 분리되는 식중독에 대한 관리 시스템 필요
식품 유래 식중독균의 유전자형 분석(PFGE)결과를 활용, 오염 경로▪오염원 확인으로 확산 및 위해식품 유통 차단
식중독 환자에서 분리한 균과 식품 및 환경에서 분리한 균의 유전자형을 비교하여 오염원과 경로를 확인함으로써 확산 및 위해 식품 유통 차단

5. DNA Migration PFGE 검사 원리 I large moderate small
Picture of DNA separation by gel electrophoresis

6. Factors of DNA Migration
PFGE 검사 원리 II
Factors of DNA Migration
Several additional factors have important effects on the mobility of DNA fragments in agarose gels, and can be used to your advantage in optimizing separation of DNA fragments.
Fig. Agarose Concentration
Chief among these factors are:
Agarose Concentration
Voltage
Electrophoresis buffer
Effects of Ethidium Bromide

7. PFGE 검사 원리 III
30~50 kb 이상 크기의 DNA는 크기에 관계없이 같은 이동성을 가지므로 하나의 큰 퍼진 band로 보임
전기영동 동안 전기장의 방향을 변화시키면 퍼져 보이는 부분은 분리되어 다른 크기의 fragment로 분리
Field inversion, Traverse alternating field electrophoresis, Rotating gels, contour-clamped homogeneous electric field(CHEF) 4가지 방법 사용
이중 CHEF gel electrophoresis 방법이 bacterial genomic DNA의 macrorestriction fragment를 분해시키는 방법으로 가장 흔히 사용

8. PFGE 검사과정 I 식중독균 PFGE 검사 매뉴얼(2010.6. 평가원 미생물과) Salmonella spp.
Escherichia coli O157:H7
Listeria monocytogenes
PFGE 표준실험법( 질병관리본부 장내세균과)
Campylobacter jejuni
Vibrio parahaemolyticus
Staphylococcus aureus
Escherichia coli

9. PFGE 검사과정 II
DNA macrorestriction 분석은 genomic DNA를 드물게 자르는 제한효소를 사용하여 10~20개의 restriction fragment를 만듦
PFGE facilitate는 전기영동 동안 전기장의 방향을 지속적으로 변화시킴으로서 agarose gel을 통해 큰 DNA fragment를 차별적으로 이동 시킴

10. PFGE 검사과정 III Sample preparation I
traditional DNA preparation: not suitable PFGE
Caution: Large DNA susceptible to shearing forces, breakage
Cell harvest-low melting-temperature agarose
Incubate in
EDTA (nuclease)
Sodium lauroyl sarcosine (detergent)
Proteinase K (remove all cell component)
Sample Preparation II
Modification: cell-wall digesting enzyme prior to proteinase K
Yeast: zymolyase or lyticase
Fission yeast(Schizosaccharomyces pombe): novozym
Escherichia coli: lysozyme
Staphylococcus aureus: lysostaphin
Plant cell: cellulysin/pectolyase

11. PFGE 검사과정 IV Restriction I Enzyme digestion, rare cutter
to cleave or modify DNA in solution
Extensive washing in TE: to remove the detergent and EDTA
Proteinase K inactivation
PMSF(phenylmethylsulfonylfluoride) - toxic
Pefabloc – less toxic
Thorough equilibration in restriction enzyme buffer
Restriction II
4h-overnight, modified double digestion
G+C content:
If>45%, 6-base cutter containing mostly A and T
DraI: TTTAAA/SspI:AATATT, AseI:ATTAAT
If>45%, CTAG is rare
SpeI: ACTAGT, XbaI: TCTAGA, NheI: GCTAGC, AvrI1: CCTAGG
If low G+C content, CCG and CGG are rare
SacI: CCGCGG, SmaI: CCCGGG, NaeI GCCGGC

12. PFGE 검사과정 V Pulse time I 4 zone in single pulse time
1st bottom: linear relationship between migration rate & molecular size
2nd: zone of nonlinearity
3rd zone of nonlinearity: maximum separation, most accurately sized in this zone
4th: unresolved bands
pulse time increase  larger molecule release from 4th zone
Pulse time II
Zero field intervals between pulses
DNA allowed to relax before reorientation in a different direction
Size-selective mobility increase
Pulse-time ramp: reduce co-migration but band inversion still occur

13. PFGE 검사과정 VI Reorientation angle: 90° ~180°
proportion to migration, slight band sharpness
CHEF: 120°: optimal, little difference in 120°~165°
Under120°: dramatic increase of migration, low resolution
Voltage ∝ migration rate
Normally 6V/cm, up to 1.5Mb
Agarose type and Conc.
Conc. Increase: decrease DNA mobility at the large end but increase band sharpness
Temperature
Proportional to migration rate
Increased Temp(434℃): twice migration rate, decreased resolution
Normally 12~15℃

14. PFGE 판독법 I 1. 육안 분석법(Tenover criteria1))
한 집단 발생 안에서 비교, 제한된 기간 또는 제한된 지역 발생 비교시 주로 이용
두 결과를 비교할때 서로 다른 위치에 있는 band의 개수로 연관관계 판단
Category
No. of genetic differences compared with outbreak strain
Typical no. of fragment differences compared with ourbreak pattern
Epidemiological interpretation
Indistinguishable
Isolate is part of the outbreak
Closely related 1
2-3
Isolate is probably part of the outbreak
Possibly related 2
4-6
Isolate is possible part of the outbreak
Different ≥3 ≥7
Isolate is not part of the outbreak
1) Tenover et al.(1995), Journal of Clinical Microbiology; 33(9):

15. PFGE 판독법 II 2. Software를 사용한 분석법
프로그램: Fingerprinting II Informatix Software(Bio-Rad), BioNumerics, Gel-Compar 등