1. Plasmid mini prep DNA electrophoresis Transformation(Expression)
6주차
생화학 및 분자생물학실험
Plasmid mini prep
DNA electrophoresis
Transformation(Expression)

2. Content Purpose Introduction & Theory Plasmid mini prep
Agarose gel electrophoresis
DNA quantitation
Transformation(Expression)
Materials & Methods
Results

3. Purpose _ Plasmid mini prep.
Plasmid mini prep kit를 이용해서 E.coli 로부터 DNA를 분리하여 정량 해보고 Agarose gel electrophoresis를 통해 확인한다.
얻어진 DNA와 Protein Expression용 Competent cell을 이용하여 Transformation한다.

4. Introduction & theory 1 2 3 Plasmid mini prep Solution 1 Solution 2
50 mM Glucose
25 mM Tris-Cl (pH 8.0)
10 mM EDTA (pH 8.0)
RNase
Solution 3 2
0.2 N NaOH
1% SDS 3
5 M Potassium acetate
glacial acetic acid
Distilled water

5. Introduction & theory Plasmid mini prep Solution Components 역할
Solution I
Glucose
삼투압 조절
EDTA
Metal ion chelating
Tris-Cl
pH 조절
RNase A
RNA 분해
Solution II
NaOH
DNA Denaturation
SDS
Cell wall lysis
Solution III
Potassium acetate
pH의 중성화 및 Plasmid DNA renaturation
Glacial acetic acid
Distilled water

6. Introduction & theory
Plasmid mini prep

7. Introduction & theory
Plasmid mini prep

8. Introduction & theory DNA quantitation Spectrophotometry
원자 또는 분자가 외부에서 빛 에너지를 흡수
→ 분자운동 (전자 전이 및 진동, 회전, 병진)
바닥 상태에 있는 원자나 분자는 그 종류에 따라 특정 파장의 자외선 및 가시광선을 흡수하며 전자전이를 일으키면서 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
흡수하는 파장 → 원자 또는 분자의 전자구조, 조성
흡수하는 빛의 세기 (흡광도) → 원자나 분자의 농도 결정

9. Introduction & theory Spectrophotometry Absorbance A= εbc
ε: molar absorption coefficient (L·mol-1· cm-1 )
b: path length (cm)
c: molar concentration of the sample) (mol/L)
double-stranded DNA (μg/ml)-1 cm-1
single-stranded DNA and RNA (μg/ml)-1 cm-1
T (Transmittance) = I1/I0 %T = 100 x T
A (Absorbance) = log10 I0/I1 = log10 1/T = log10 100/%T = 2-log10 %T

10. Introduction & theory Spectrophotometry Absorbance - A260: DNA
- A280: Protein
- A260/280: Purity (DNA and RNA: 1.8 and 2.0)
- A260= → 50 μg/ml double-stranded DNA
→ 40 μg/ml single-stranded DNA
→ 20 μg/ml single-stranded oligonucleotide
* Cuvette
- glass : visible ( >370nm)
- quartz cell : UV & visible
- plastic cell : visible

11. Introduction & theory
Intensity of fluorescence emitted by ethidium bromide
: Comparison with fluorescence intensity of the quantified DNA size marker.
As little as 1-5 ng of DNA can be detected by this method.

12. Introduction & theory
Intensity of fluorescence emitted by ethidium bromide
Agarose gel Electrophoresis

13. Introduction & theory
Intensity of fluorescence emitted by ethidium bromide
Agarose gel Electrophoresis

14. Introduction & theory
Intensity of fluorescence emitted by ethidium bromide
Agarose gel Electrophoresis

15. Materials & Method
Plasmid mini prep.
Agarose gel electrophoresis

16. Plasmid mini prep. Cell pre-inoculation
지난 시간에 Transformation을 통해 얻은 colony 1개를 Amp이 들어간 5 ml LB media에 접종한다.
접종 후 37ºC incubator에서 16~18시간 incubation한다.
Incubation이 끝난 후 Plasmid mini prep kit를 사용하여 Plasmid DNA를 추출한다.

17. Plasmid mini prep. LaboPass Plasmid mini prep Kit
Cell culture 5ml을 Centrifuge하여 Cell Down시킨다. 그 후 Pellet만 남기고 Supernatant는 제거한다.
Pellet에 Buffer S1 250μl를 섞어 Pellet을 풀어준다. (Vortexing)
Buffer S2 250μl를 섞어준다. (Inverting 4~5회)
Buffer S3 350μl를 섞어준다. (Inverting 4~5회)
10분 동안 Centrifuge한다.
Centrifuge 후, Supernatant을 Spin column으로 옮긴다. 그리고 30초간 Centrifuge를 해준다.
Wash Buffer 700μl를 섞고 30초간 Centrifuge를 해준다.
추가로 Centrifuge를 1분간 더 해준다. (건조)
Spin column에 dH2O 50μl를 첨가한다. 그리고 1분간 Centrifuge를 해준다.

18. Agarose gel electrophoresis
& Quantitation
Agarose gel Electrophoresis
Plasmid mini prep 후 얻어진 Plasmid DNA를 전기영동으로 확인해본다.
DNA quantitation
Spectrophotometer를 OD260으로 setting.
3’DW 200μl 로 blank를 잡는다.
3’DW 198μl + DNA 2μl를 넣어 만든 sample의 흡광도를 측정하여 DNA의 농도를 확인한다.

19. Results Agarose gel 사진을 통해 Plasmid mini prep 이 잘 되었는지를 확인
Colony의 확인을 통해 Transformation이 잘 되었는지를 확인