1. 1/28 05/09/2016 Le diagnostic bactériologique Prof. Gérard Lina UE 13 Agents infectieux Année Universitaire 2016-2017

2. 2/28 05/09/2016 OBJECTIFS Connaître les méthodes microbiologiques utilisées pour l’identification des agents infectieux Comprendre le rôle de l’information clinique dans l’analyse microbiologique Identifier les limites du laboratoire de bactériologie

3. 3/28 05/09/2016 PLAN Croissance bactérienne Identification bactérienne Réponse immunologique à l'infection Chronologie de l'analyse bactériologique Outils d'investigation d'épidémie

4. 4/28 05/09/2016 CONNAISSANCES ANTERIEURES Quelle bactérie connaissez vous ? Quelle est sa structure ? Comment les identifier ?

5. 5/28 05/09/2016 CROISSANCE BACTERIENNE Multiplication des bactéries par multiplication http://www.youtube.com/watch?v=gEwzDydciWc&feature=related

6. 6/28 05/09/2016 CROISSANCE BACTERIENNE Différents types de milieux de cultures Milieu liquide Broth medium Milieu gélosé Agar plate 1 colonie ≈ 10 12 bactéries

7. 7/28 05/09/2016 DECTION DE CROISSANCE Milieu liquide Automates d’hémocultures Milieu gélosé Incubateurs intelligents

8. 8/28 05/09/2016 CONDITIONS DE CROISSANCES Monsieur B, 71 ans, diabétique, consulte pour douleur pied gauche. Examen : Fièvre 39°C, aspect noirâtre et nécrotique du dessus du pied Biopsie pour analyse bactériologique : –Coloration de Gram : cocci Gram + et bacille Gram - –Culture sur gélose au sang et incubation de 24h à 37°C –1 seul type de colonie correspondant à des cocci à Gram Positif en chaînette. Comment expliquez-vous l’absence de colonie correspondant au bacille à Gram négatif ?

9. 9/28 05/09/2016 CONDITIONS DE CROISSANCES Toutes les bactéries n’ont pas les mêmes exigences Nutriment – Simple -> complexe « Facteur de croissance » – Culture cellulaire « intra-cellulaire » – Non cultivable Atmosphère : concentration en oxygène – Aérobie strict à anaérobie strict Température 37°C Temps de multiplication (min à jour)

10. 10/28 05/09/2016 CONDITIONS DE CROISSANCES Utiliser le bon mode de prélèvement Identifier précisément le prélèvement Prévenir lors de suspicion d’infection à : – Mycobactérie – Légionellose – Mycoplasme – Chlamydia – Rickettsie Adéquation du prélèvement ? – Syphilis – Lèpre Milieux spéciaux pour la culture Ne cultive pas

11. 11/28 05/09/2016 IDENTIFICATION BACTERIENNE Pourquoi avons-nous besoin d’identifier les bactéries des prélèvements cliniques ?

12. 12/28 05/09/2016 IDENTIFICATION BACTERIENNE Pourquoi avons-nous besoin d’identifier les bactéries des prélèvements cliniques ? A chaque espèce bactérienne : – certain panel d’infections (diagnostic) – degré de virulence (pronostic) – spectre de sensibilité aux antibiotiques (traitement)

13. 13/28 05/09/2016 IDENTIFICATION BACTERIENNE Caractéristiques phénotypiques –Morphologiques –Biochimiques –Antigéniques Caractéristiques génétique –Recherche de gène spécifique d’espèce –Gène conservé au sein des procaryotes »Séquence du gène de l’ARN ribosomal 16S

14. 14/28 05/09/2016 IDENTIFICATION MORPHOLOGIQUE Uniquement orientation Cocci Gram positif en amas = staphylocoques Cocci Gram positif en chaînette = streptocoques Bacille Gram positif = Clostridium, Listeria Cocci Gram négatif méningocoque Bacille Gram négatif entérobactérie Pseudomonas …..

15. 15/28 05/09/2016 IDENTIFICATION BIOCHIMIQUE Rare docteur-test : nitrite, uréase Besoin d’une culture bactérienne préalable Ensemencement de colonies pures, temps d’identification en jour >> heure

16. 16/28 05/09/2016 IDENTIFICATION BIOCHIMIQUE CocciBacille Gram + Gram - AmasChaînette Catalase + Catalase - StaphylocoqueStreptocoque Gram + Gram - MéningocoqueListeria Clostridium …. Nitrite + Oxidase - EnterobactériePseudomonas ….. Nitrite - Oxidase + ImmobileMobile

17. 17/28 05/09/2016 IDENTIFICATION BIOCHIMIQUE Spectrométrie de masse Colonie, réponse en quelque minute

18. 18/28 05/09/2016 ANTIBIOGRAMME

19. 19/28 05/09/2016 IDENTIFICATION IMMUNOLOGIQUE Identification des antigènes bactériens spécifiques Prélèvement ou colonie, en quelque minute Anticorps spécifiques Particule de latex Particule fluorescente Immuno- flororescence Immuno- agglutination

20. 20/28 05/09/2016 IDENTIFICATION IMMUNOLOGIQUE Identification des antigènes bactériens spécifiques Test immuno-chromatographique Antigène urinaire : Légionnelle Pneumocoque Streptest

21. 21/28 05/09/2016 IDENTIFICATION MOLECULAIRE A partir du prélèvement ou de colonie Cibles moléculaires : –gène spécifique »identification de l’espèce »recherche de facteur virulence »gène de résistance aux antibiotiques gène codant l’ARN ribosomal16S spécifique aux bactéries

22. 22/28 05/09/2016 PCR SÉQUENÇAGE ARN16S PCR Prélèvement Séquençage

23. 23/28 05/09/2016 CHRONOLOGIE DE L’ANALYSE BACTÉRIOLOGIE Prélèvement (t=0) Transport du prélèvement au laboratoire (t=2h max) Examen direct (t=1h) –microscopie otique : mobilité, coloration de Gram (forme arrangement, couleur) –+/- test immunologique –+/- test moléculaire Culture (t=24h) –ensemencement, lecture le lendemain Identification bactérienne (t=24-/48h) –méthode rapide (t=24h) –méthode nécessitant une nouvelle culture (t=48h) Antibiogramme (t=48h)

24. 24/28 05/09/2016 REPONSE IMMUNOLOGIQUE B Sérologie : identification de la réponse Ac –Syphilis –Lyme (maladie) –Brucellose –Rickettsiose – Coxiella –Legionellose –Mycoplasme –Chlamydiose –Leptospirose

25. 25/28 05/09/2016 REPONSE IMMUNOLOGIQUE T Tuberculose : Quantiferon

26. 26/28 05/09/2016 INVESTGATION D’EPIDEMIE Epidémie = plusieurs cas d’infections suspects d’être provoquées par la même bactérie Importance médico-légale, infections liées aux soins/nosocomiales Outils de comparaison des souches –Phénotypique : »biotype, antibiogramme, sérotype… –Génotypiques : »outils moléculaires : électrophorèse de l’ADN bactérien, séquençage de gènes cibles, génome entier…

27. 27/28 05/09/2016 A RETENIR o Croissance bactérienne o milieu liquide et milieu solide o conditions de croissance variable d’une bactérie à l’autre, condition de prélèvement o Bactérie nécessitant des milieux spéciaux et bactérie non cultivable o Diagnostic direct : identification de la bactérie o Identification phénotypiques, morphologie coloration de Gram, test biochimique, test antigénique o Identification génotypique : gène spécifique, ARN 16S o Diagnostic indirect : sérologie bactérienne, réponse T à l'infection o Chronologie de l'analyse bactériologique et délais de réponse

28. 28/28 05/09/2016 MOTS EN ANGLAIS o Specimen processing o Clinical specimen sampling o Transport/ storage o Direct methods o Gram staining o Liquid medium inoculation o Agar plate streaking o Bacterial identification o Antimicrobial agent susceptibility testing

29. 29/28 05/09/2016 REFERENCES o C. Nauciel et JL Vildé, Bactériologie médicale, Masson o REMIC 2010, Référentiel en microbiologie médicale, Société Française de Microbiologie o http://www.microbes- edu.org/etudiant/etudiants.html

30. 30/28 05/09/2016 Des questions UE 13 Agents infectieux 05/09/2016 Prof Gérard Lina gerard.lina@chu-lyon.fr