1. TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG TỰ THÂN ĐIỀU TRỊ BỎNG SÂU Ở TRẺ EM Huỳnh Duy Thảo , Nguyễn Bảo Tường , Trần Thị Thanh Thủy , Trần Công Toại   Bộ môn Mô – Phôi, ĐHYK Phạm Ngọc Thạch  Khoa Bỏng, BV. Nhi Đồng I

2. NỘI DUNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3 KẾT QUẢ 4 KẾT LUẬN 5

3. ĐẶT VẤN ĐỀ

8. SỐ LIỆU BV. NHI ĐỒNG I Mỗi năm có khoảng 2000 bệnh nhi khám và điều trị tại khoa bỏng 1/3 bỏng < 10% diện tích cơ thể 1/3 bỏng rộng > 30% (80 – 90%) => nhóm bệnh có nguy cơ tử vong cao, nguy cơ tàn tật cao và mang di chứng ảnh hưởng nặng nề đến thẩm mỹ

9. CHI PHÍ ĐIỀU TRỊ Vài trăm ngàn => vài chục triệu Cá biệt : 120.000.000 đồng => thực hành giảm chi phí kháng sinh/ngày đ iều trị

10. GIẢI PHÁP ĐIỀU TRỊ BỎNG NẶNG Ở TRẺ EM 1/3 bỏng rộng > 30% diện tích cơ thể  Tìm được nguồn da ghép để ghép sớm  Khó khăn: + Không ghép được nguồn da đồng loại, dị loại + Chỉ sử dụng được vật liệu che phủ: màng trung bì, màng ối, màng collagen nhận tạo …

11. ĐÂY LÀ NHÓM CẦN THIẾT PHẢI ĐƯỢC GHÉP DA VÌ:  Có nguy cơ tử vong cao  Cần nhiều da để ghép  Chi phí điều trị cao: nằm viện lâu, dùng nhiều kháng sinh …

12. MỤC TIÊU CUỐI Trẻ hòa nhập hoàn toàn với xã hội  Không tàn tật  Không tự ti, mặc cảm về ngoại hình  Nâng cao chất lượng cuộc sống

14. BỎNG SÂU Ở TRẺ EM TH1 TH2 TH3 ẢNH HƯỞNG RẤT NẶNG NỀ ĐẾN BẢN THÂN, GIA ĐÌNH VÀ XÃ HỘI

15. BỎNG SÂU Ở TRẺ EM TH1 TH2 TH3 GIẢI PHÁP GHÉP DA TỰ THÂN

16. BỎNG SÂU Ở TRẺ EM TH1 TH2 TH3 GIẢI PHÁPHẠN CHẾ

17. BỎNG SÂU Ở TRẺ EM TH1 TH2 TH3 GIẢI PHÁP TẤM TẾ BÀO SỪNG

18. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

19. CẤU TẠO MÀNG ỐI

21. THU NHẬN MÀNG ỐI

22. CẤU TẠO MÔ DA Tế bào lớp đáy Tế bào lớp gai Tế bào lớp hạt Phóng thích thể mỏng Thể mỏng Hạt keratohyalin Bộ máy Golgi Thể mỏng Ty thể Ribosom Màng cơ bản Tế bào hóa sừng Vỏ tế bào

24. Lớp sừng Lớp gai Lớp hạt Lớp đáy C Ơ CHẾ TỰ ĐỔI MỚI

25. CƠ CHẾ BIỆT HÓA Tế bào gốc biểu mô Tế bào khuếch đại chuyển Tế bào gốc biểu mô Các tế bào biểu bì đã biệt hóa Tế bào gốc Biểu mô Tế bào khuếch đại chuyển

26. ĐỊNH DANH TẾ BÀO SỪNG Tế bào gốc Tự làm mới Tế bào khuếch đại chuyển Biệt hóa Tế bào đang biệt hóa ở hậu kỳ của gián phân Tế bào lớp gai Tế bào lớp hạt Tế bào lớp vảy sừng

27. ĐỊNH DANH TẾ BÀO SỪNG - Nhuộm p63: đỏ - Nhuộm involucrin: xanh lá cây

30. Màng l ọc của đĩa lồng T ế bào sừng M ô i tr ường nuôi tế bào sừng Màng collagen MÔ HÌNH TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG Đĩa lồng

31. M ẫu da người Nuôi, nhân tế bào sừng C ấy tế bào sừng lên màng collagen Tạo nhiều lớp tế bào sừng trên màng collagen Đánh giá Phân lập tế bào Màng collagen L oại biểu mô Màng ối người Theo dõi, đánh giá sản phẩm Ghép tự thân trên bệnh nhân

32. TẠO MÀNG COLLAGEN TỪ MÀNG ỐI -Hóa chất: + Nước cất + Dung dịch PBS + Nước muối sinh lý + Trypsin 0.25%

33. ĐÁNH GIÁ MÀNG ỐI B A Kết quả nhuộm trichrom (A) và nhuộm PAS (B) của màng ối đã loại biểu mô

34. Màng ối được thu nhận trong DPBS – kháng sinh Rửa, lắc trong DPBS cho sạch máu Cạo bỏ lớp tế bào biểu mô Đóng gói Lắc trong trypsin/EDTA 30 phút, 37 o C Để khô tự nhiên trong tủ cấy khoảng 2 giờ Chiếu xạ bằng tia , suất liều 25kGy Bảo quản ở nhiệt độ phòng

35. GIÁ THỂ NUÔI CẤY TẾ BÀO SỪNG GIÁ THỂ = Màng collagen (từ màng ối người)

37. TH1 TH2 TH3 PHÂN LẬP, NUÔI CẤY, NHÂN KHỐI TẾ BÀO SỪNG TH1 TH2 TH3

38. MẪU DA AB

39. QUY TRÌNH Mẫu da được thu nhận trong DPBS – kháng sinh Rửa trong DPBS, loại bỏ lông, mỡ, một phần lớp trung bì Cắt thành từng mảnh nhỏ Tách rời lớp biểu bì và lớp trung bì Thay môi trường sơ cấp bằng môi trường không huyết thanh Ủ trong trypsin 0,25% - EDTA 0,02% (tỷ lệ 1 - 4) 18 giờ, 4 o C Huyền phù để thu nhận tế bào sừng rời Nuôi tế bào trong môi trường sơ cấp ở 37 o C, 5% CO 2 với mật độ 3 x 10 5 tế bào/cm 2 bề mặt chai nuôi trong 2 ngày Nuôi tế bào ở 37 o C, 5% CO 2, thay môi trường 2 ngày/lần

40. Biểu bì Trung bì

41. Biểu bì Trung bì

42. Biểu bì Trung bì

44. Đ Ư ỜNG CONG TĂNG TR Ư ỞNG

45. ĐÁNH GIÁ NST ĐỒ

46. KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN GIEN M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 300bp 600bp 500bp 400bp + M - Thang + 1, 3, 5, 7, 9 - Sản phẩm khuếch đại các gen tương ứng p63 (440bp), K14 (390bp), K5 (475bp), involucrin (373bp),  -actin (587bp) + 2, 4, 6, 8, 10 - Sản phẩm khuếch đại gen của mẫu da bình thường đối chứng tương ứng p63, K14, K5, involucrin,  -actin

47. TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG

48. ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP A B Tế bào sừng tăng sinh tạo lớp đơn trên màng collagen

49. ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP Kết quả tạo tấm tế bào sừng. Tấm tế bào sau 7 ngày nâng lên bề mặt không khí (A Kính hiển vi đảo ngược, 100X) và (B, H&E). A B

50. ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP A Màng collagen B Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch cho tấm tế bào sừng. Sau 7 ngày các tế bào bắt màu nâu: dương tính p63. A: Mẫu nghiên cứu B: Mẫu da người

51. ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP Màng collagen

52. ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP

54. BÁO CÁO SƠ BỘ NHỮNG TRƯỜNG HỢP NUÔI CẤY DA ĐÃ THỰC HIỆN

56. BÁO CÁO SƠ BỘ NHỮNG TRƯỜNG HỢP NUÔI CẤY DA ĐÃ THỰC HIỆN

59. BÁO CÁO SƠ BỘ NHỮNG TRƯỜNG HỢP NUÔI CẤY DA ĐÃ THỰC HIỆN

62. KẾT LUẬN

63. Thứ nhất, tấm tế bào sừng có thể dùng điều trị tổn thương mất da ở trẻ em => giảm diện tích da cho để ghép, giảm đau hậu phẫu và cho sẹo mềm mại hơn so với kỹ thuật ghép da mỏng hiện đang sử dụng. Thứ hai, việc sử dụng tấm tế bào sừng vẫn còn những khó khăn như diện tích da nuôi cấy chưa đủ che phủ toàn bộ thương tổn, khó đánh giá độ bám dính, sẹo vẫn phì đại, đỏ và ngứa nhưng tốt hơn sẹo do ghép da mỏng hoặc để lành tự nhiên. Thứ ba, cần nghiên cứu thêm để giải quyết những tồn tại trên và nghiên cứu thêm để nhuộm màu cho tấm tế bào sừng để đáp ứng nhu cầu thẩm mỹ, ghép thêm tấm lưới sợi trên bề mặt tấm tế bào sừng để cố định mảnh ghép tốt hơn, gửi mẫu nuôi cấy nhiền đợt để có thể che phủ toàn bộ vết thương …

64. HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Thứ nhất, đồng nuôi cấy tế bào sắc tố để tạo màu sắc cho mảnh ghép. Thứ hai, thử nghiệm nuôi trực tiếp không qua nhân khối để rút ngắn thời gian ghép cho bệnh nhi. Thứ ba, ghép thành nhiều đợt để gia tăng thể tích ghép cho bệnh nhi.