Download presentation
Presentation is loading. Please wait.
1
מהפכת ה PCR We should amplify targets I want to look up your genes
2
(reverse transciptase)
Overview of RT-PCR tissue extract RNA copy into cDNA (reverse transciptase) do real-time PCR analyze results
3
הכנת cDNA
4
אמפליפיקציה של RNA – התבטאות גנים
tissue extract RNA copy into cDNA (reverse transciptase) do quantitative PCR analyze results
5
מה רע בגל אגרוז? מראה תוצאה סופית של התהליך תוצאות לא מבוטאות במספרים
איכותי ולא כמותי
6
חשיבות הקריאה בשלב האספוננציאלי
Traditional PCR הכימות המדויק
7
ASSAYING COPY NUMBER: REAL-TIME PCR
Agarose Gel Area for Real-time PCR detection Traditional PCR detection Problems with traditional end-point detection: Low sensitivity Low resolution Poor precision
8
Readout SYBR Green I Currently, there are two available chemistries for the 7700/ We’ll describe both in brief.
9
SYBR Green Dye Assay Binds to any double-stranded DNA
- Specific product - Non-specific product - Primer dimers
10
Readout TaqMan Currently, there are two available chemistries for the 7700/ We’ll describe both in brief.
11
DNA Polymerase 5' Exonuclease Activity
12
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
In addition to the 5’ nuclease activity, TaqMan utilizes FRET or energy transfer. The 5’ reporter dye has a higher energy than the 3’ quencher dye. When the probe is intact, energy from the 5’ dye is transferred (energy flows down hill) to the 3’ dye. Thus, the intact probe has a low emission from the 5’ dye and high emission from the 3’ dye. When the probe is cleaved, the distance between the two free dyes increases to the extent that the energy transfer cannot occur. Thus, the 5’ dye now has a greater emission than the 3’ dye.
14
TaqMan בשימוש Real Time PCR Polymerization causes Hydrolysis
TaqMan® Probe Forward Primer R Q 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Reverse Primer
15
TaqMan בשימוש Real Time PCR
5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’
16
Amplification Plot – Standard Curve
מיהולים כפולים
17
(reverse transciptase)
Overview of RT-PCR tissue extract RNA copy into cDNA (reverse transciptase) do real-time PCR analyze results
18
חשיבות הפריימרים ספציפיות יעילות ללא primer-dimers
לא נותן סיגנל שמקורו ב DNA cross exon/exon boundary
19
פרימרים המבדילים בין DNA ל mRNA
EXON 1 INTRON 2 EXON 2 DNA EXON 1 EXON 2 mRNA EXON 1 EXON 2 mRNA
20
ביקורות ל RT-PCR איכות הדגימה – Reference mRNA
התבטאות (שווה בתאים שונים) גודל (דומה ל mRNA הנבדק) mRNA ולא DNA בלי Alternative Splicing באזור הפריימרים
21
מניעת התחלה מוקדמת של פעילות בטמפרטורה נמוכה
Hot Start PCR מניעת התחלה מוקדמת של פעילות בטמפרטורה נמוכה
22
Taq automatic hot start
Temperature Cycling PCR Assembly Initial Template Denaturation 94oC, 30s - 3 min Inactive Taq DNA Polymerase Fully Active Taq DNA Polymerase
23
Hot start PCR
Similar presentations
