1. פרויקט בקורס מבוא לביואינפורמטיקה
חיפוש מנגנון בקרת ביטוי חדש בטפילים פוליציסטרונים ובחד תאים נמוכים, הפועל על עיקרון מנגנון unfolded protein response בשמר וביונקים.
מיכל מעוז
גיל רובין

2. אולם איך מבוטאים בזמן העקה רק חלק מהגנים מתוך יחידת RNA גדולה??
מנגנוני בקרת ביטוי בטפילים פוליציסטרונים
Leishmania, ו-trypanosoma, הם טפילים חד תאיים פוליציסטרונים.
אורגניזמים אלה ייחודיים באופן אירגון הגנום:
- גנים המקודדים לחלבונים שונים ערוכים ברצף ועוברים שעיתוק כיחידה אחת.
- הבקרה על רמת החלבונים בשלבי ההתמינות של אורגניזמים אלו נעשית בעיקר לאחר השיעתוק.
ידוע כי התמינות הטפילים מתרחשת בתנאי עקת חום.
אולם איך מבוטאים בזמן העקה רק חלק מהגנים מתוך יחידת RNA גדולה??

3. מנגנון unfolded protein response בשמר
1. חלבון Ire1 מוחזק ע"י צ'אפרון.
2. בזמן עקה חלבונים ב-ER עוברים misfolding.
3. הצ'אפרונים עוזבים את ה-Ire.
4. Ire1 עובר דימריזציה וזרחון עצמי.
5. Ire1 חותך intron ב-mRNA של פקטור השיעתוק HAC1.
6. HAC1 מתורגם לחלבון.
7. חלבון HAC1 גורם לביטוי גנים הנדרשים לטיפול בעקה.

4. חלבון Ire1 – מנגנון ייחודי לחיתוך RNA
מבנה ייחודי:
דומיין קינאז ואחריו דומיין אנדוריבונוקלאז.
קינאז
חיתוך RNA:
זרחון הקינאז גורם להפעלת דומיין אנדוריבונוקלאז שמזהה intron שבקצותיו שני מבני stem-loops ב- HAC1, וחותך אותו ללא תיווך של spliceosomes.
אנדוריבונוקלאז
HAC1 – mRNA:
נמצא בתא כל הזמן, ורק בזמן עקה, לאחר החיתוך על-ידי Ire1 מתבטא לחלבון.

5. הגדרת הבעיה
מטרתינו היא חיפוש הומולוגים לחלבון ה-Ire1 ולאיזור החיתוך של HAC1-mRNA בחד תאים אאוקריוטים נמוכים בכלל, ובטפילים בפרט.
מציאתם תוכל לרמז על קיום מנגנון בקרה שלאחר שיעתוק חדש, אשר בתנאי עקה גורם לחיתוך אזורים ספציפיים ב- RNA אשר מוביל לביטוי גנים האחראים לשינויים ההתפתחותיים הנדרשים בטפיל.
animals
fungi
plants
ciliates
Slime molds
flagellates

6. דרך העבודה והכלים הומולוגים ל-Ire1:
בחירת חלבונים להשוואה מתוך אורגניזמים רלוונטיים על ידי standard protein-protein Blast על ה-Ire1.
חקירת איזה חלק מתוך אזורי ההתאמה המקומיים שהתקבלו על ידי ה- Blast שייכים לדומיין הקינאז של ה-Ire1 , איזה חלק שייך לדומיין האנדוריבונוקלאז שלו, ואיזה חלק שייך לדומיינים האחרים על ידי Swiss port .
חיזוי המבנה השניוני של ה-Ire1 ושל החלבונים המושווים על ידי Psipred.
השוואת המבנים השניוניים שהתקבלו בדגש על הדומיינים קינאז ואנדוריבונוקלאז.

7. דרך העבודה והכלים הומולוגים ל-HAC1:
חיפוש הומולוגים באורגניזמים רלוונטיים על-ידי
standard nucleotide nucleotide Blast על רצף ה- HAC1.
חיזוי מבנה שניוני של ה- RNA Hac1 על ידי MFOLD וחיפוש מבנים דומים של RNA באורגניזמים הרלוונטים, בעיקר באזור הנחתך על ידי ה-Ire1.

8. תוצאות החלבונים הנבחרים:
putative mitogen-activated protein kinase kinase 2
[Leishman mexicana [
putative protein - strong similarity to unknown protein
[[Diktyostlium discoideum
Calcium-dependent protein kinase
[[ Plasmodium falciparum

9. תוצאות Blast לחלבונים הנבחרים:
Plasmodium
67.8
8e-10
580
Diktyostlium
157
8e-37
1431
Leishmania
69.3
2e-10
1090
האורגניזם
Score
E-value
מספר חומצות אמיניות

10. תוצאות השוואת ההתאמות לפי דומיינים:
Leishmania: כל ההתאמות התקבלו בדומיין הקינאז.
Diktyostlium: 71% מההתאמות התקבלו בדומיין הקינאז, ו- 29% התקבלו בדומיין האנדוריבונוקלאז.
Plasmodium: 82% מההתאמות התקבלו בדומיין הקינאז,
ו - 18% התקבלו בדומיין האנדוריבונוקלאז.

11. תוצאות השוואת מבנים שניוניים:
בכל החלבונים התקבל דמיון רב במבנה השניוני ל-Ire1 בדומיין הקינאז. (צפוי....)

12. השוואת המבנה השניוני בדומיין האנדוריבונוקלאז של ה-Ire1:
חלבון ה- Diktyostlium:
באזור זה נמצא דמיון רב באופן יחסי בין המבנים השניוניים אשר נחזו לשני החלבונים.
CCCC CCCCCCCCCCCCCCCCC CCCHHHHHHH CCCCCCC CCCCCCCCCCCHHHHHHHHHHH CCCCC HHHH
Ire1: FWPKSKKLEFLLKVSDRLEIEN RDPPSALLMKF DAGSDFV IPSGDWTVKFDKTFMDNLERYRKYH S SKLMDL
FW K++F L+ N S LL D S W D D++ E Y DL
Ddp: FWSTNEK IKFYESSLNLLKDPNNSQSKHSKLLNYYQNDNSGGVLFLSKPWNQI IDPFL I DHVENNNAYQYDYQVRDL
CCCCCCC CCCCCCCCCCCCCCCCCCHHHHHHHHH HHCCCCCCCCCCCHHHCCC HHHHHHHCCCCCCCCCHHHHH
HHHHHHHCCCCCCCCHHHHHHCCCCC C CCCCHHH H CCCH HH H H HHHHHHHH
Ire1: LRALRNKYHHFMDLPED I AELMGPVP D GFYDYF T K R FPN L L I G VYM IVKEN
+R + RN H D I P YF F P+ L L Y K++
Ddp: VRC I RNSLVHHKD I LRS I TQQQ NLP P S S KE F AN DCLK S QE SV LL YF E C KF PD L L F HLY QQF KKS
HHHHHHHHHHHHHHHH HHHHCCCC HHH HH HHC C CCCC CC CHHH HHH H HCCHH H HHHHH HHHHC
עובדה זו בצירוף תוצאות הדמיון במבנה הראשוני של דומיין זה מחזקת את ההשערה כי לחלבון זה עשוי להיות תפקיד דומה לזה של חלבון ה- Ire1 .

13. השוואת המבנה השניוני בדומיין האנדוריבונוקלאז של ה-Ire1:
חלבון ה- Plasmodium :
התקבל דמיון מסוים במבנה השניוני, אך לא ניתן לומר האם זהו דמיון משמעותי.
CCCCCCCC CC CC CCC CCCC CCCCCCHHHHHHHHCC CCCC CCC CCCCCC CC CCHHH
Ire1: FWPKSKKLE F L LKV S DRLE I ENRDPP SA LLMKF DAGSDF V IP SGDWTV KF DKTFM
W K KK F LL+ KF I S D+ V K TF+
Pfp: WFKKKKYAFNMDMKMDIHVLE NFKN YGLLLKFQKL AMT I I AQQSNDYDVEK LKS TF L
CCC CCCCCCC CC CC CCCCCHHHHCCHHHCCHHHHHHHHHHHCCCCHHHHHHHHHHHH
HHHHHHHHCCCCCHHHHHHHHHHHCCCCCCCCHHHHHHCCCCCCCCCCHHHHCCCHHHHHHHHHHHHHCCCCHHHHHHCCC
Ire1: DNLERYRK YHSSKLMDLL RALRNKYHHFMDLPED I AELMGPVPDGFYDYFTK RFP NLL I GVYM IVKEN LSDDQ I LRE F LYS
Pfp: VLDEDGKGY I TKEQLKKG LEKDGLKLPYN FDLLL DQ IDS DGSGKI DYTEFI A AALDRKQLS KK LI YCAFRV FDVDNDGE IT
HCCCCC CCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HH HCCCCCCEE EHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCC CC

14. השוואת המבנה השניוני בדומיין האנדוריבונוקלאז של ה-Ire1:
חלבון ה-leishmania:
התקבל דמיון חלש בלבד במבנה השניוני בדומיין זה.

15. תוצאות חיפוש הומולוגים ל-HAC1 mRNA
חיפוש לפי הרצף לא הניב אף תוצאה משמעותית.
חיפוש לפי מבנה שניוני:

16. מסקנות
סביר כי ה- Hac1 אינו סובסטרט ייחודי מבחינת רצף הנוקלאוטידים שלו עבור יכולת החיתוך של ה- Ire1 .
אי מציאת הומולוגים לא שוללת הימצאות RNA הנחתך בצורה דומה בטפילים ובחד תאים נמוכים.

17. מסקנות
טפיל ה-leishmania (הפוליציסטרונית) - לא נתגלו רמזים המעידים על קיום מנגנון בקרה חדש בניגוד להשערתינו.
טפיל ה-Plasmodium - התוצאות אינן משמעותיות במידה מספקת. לא ניתן להסיק מהן על קיום או אי קיום של המנגנון המבוקש.
חד התא Diktyostlium - נמצאו סימנים משמעותיים למדי כי החלבון שהושווה דומה במבנהו ובתפקידו ל- Ire1 ולכן ייתכן כי בזמן עקה הוא נוטל תפקיד בבקרת ביטוי גנים הדרושים להתמיינות, על ידי חיתוך ספציפי של RNA .

18. מסקנות
animals
fungi
plants
ciliates
Slime molds
flagellates

19. כיווני מחקר עתידיים
מחקר ביולוגי אשר יאשר את השערתנו לגבי תפקידו של החלבון ב- Diktyostlium.
פתרון המבנה השלישוני של Ire1, ושל החלבונים שחקרנו, והשוואתם.

20. סוף!