1. Vibrio & Yersinia

3. گونه های مختلف جنس ویبریو که باعث عفونت در انسان می شوند.

4. خصوصیات ویبریو ها
باسیلهای گرم منفی خمیده به شکل ویرگول می باشند که در محیط کشت بعد از ساب کالچر بصورت دراز ، موازی و صاف دیده می شوند.
دارای حرکت سریع می باشند(Dartmotion). این حرکت آنها توسط یک تاژک قطبی انجام می شود(مونوتریکوس)
بدون اسپور هستند.
بی هوازی اختیاری هستند.
تست کاتالاز آنها مثبت می باشد.
تست اکسیداز آنها مثبت می باشد
نیترات را به نیتریت احیاء می کنند. اکثرا آنزیمهای آمیلاز، ژلاتیناز و لسیتیناز و لیپاز تولید می کنند.
کربوهیدراتها را با تولید اسید و بدون گاز تخمیر می کنند.

5. خصوصیات ویبریوها
اکثر گونه های ویبریو نمک دوست بوده و برای رشد به NaCl نیاز دارند. البته ویبریو کلرا نمک دوست نیست
ویبریوها PH اسیدی را تحمل نمی کنند ولی PH قلیایی ( ) را تحمل می کنند.
ویبریوها در حرارت 55 درجه سانتیگراد در عرض 15 دقیقه غیر فعال می شوند.
در دمای بین درجه رشد می کنند.
ویبریو کلرا در آب تنها 7-4 روز زنده می ماند و نسبت به اسید و خشکی حساس است.
ویبریوکلرا ( بایوتایپهای کلاسیک و التور و O139 موجب بیماری وبا در انسان می شوند. در صورتیکه سایر ویبریوها ممکن است سپسیس یا آنتریت ایجاد کنند

6. تشخیص آزمایشگاهی
نمونه مدفوع را در اوائل بیماری حاد باید در داخل ظروف استریل جمع آوری کرد و مستقیما به محیط نوترینت آگار یا محیط نمکی حاوی صفرا- آگار منتقل کرد. زیرا ویبریوها به تعداد 107 تا 109در هر میلی لیتر وجود دارند.
آزمایش نمونه هایی از مدفوع بیماران بهبود یافته یا ناقلین مشکوک که سوابهای مرطوب از مقعد آنها گرفته شده مطمئن تر است.
این نمونه ها باید در محیط انتخابی پپتون واتر قلیایی (PH=8.4) حاوی 0.1تا 0.2درصد تیپول (جهت جلوگیری از رشد باکتریهای تولید کننده اسپور) کشت داد.
پس از 6 تا 8 ساعت بایستی نمونه را از محیط پپتون واتر بر روی پلیت اختصاصی TCBS و یک لوله پپتون واتر دیگر کشت داد.
در صورتیکه زمان رسیدن نمونه به آزمایشگاه طولانی باشد (12 تا 24 ساعت) نمونه را باید در محیط انتقال مانند کری-بلر یا الکالن توروکولات تلوریت مایع (PH=9) به آزمایشگاه ارسال نمود.

7. میکروسکوپی ویبریو ها
در موارد ضروری، نمونه تازه اسهال بیمار را در میکروسکوپ یا میدان تاریک مورد بررسی قرار می دهند که باسیل های خمیده ویرگولی شکل دیده می شود. در رنگ آمیزی گرم نیز باسیل گرم منفی ویرگولی شکل مشاهده می گردد.

8. متداولترین محیطهای کشت
آب پپتونه قلیایی (PH=8.4) حاوی 0.1تا 0.2درصد تیپول که از رشد اسپور جلوگیری می کند.

9. متداولترین محیطهای کشت
TCBS (تیوسولفات- سیترات- بایل- ساکارزآگار) با PH=8.5 که فقط باعث رشد ویبریوها می شود. پس از کشت نمونه و 24 ساعت گرمخانه گذاری در 37 درجه سانتی گراد، کلنی های زرد رنگی به روی محیط ظاهر می شود که نشاندهنده تخمیر ساکاروز است. در صورتیکه ویبریوهای دیگر کلنی های سبز ایجاد می کنند.

10. متداولترین محیطهای کشت
تست سرولوژی اگلوتیناسیون: با لام توسط آنتی سرم اختصاصی
باکتری به روی کلنی های ایجاد شده در محیط KIA و TSI بصورت عمقی و سطحی کشت می دهیم. پس از 24 ساعت، سطح محیط KIA قلیایی (قرمز) و عمق محیط اسیدی (زرد) می شود و هیچگونه گازی در لوله مشاهده نمی شود. در صورتیکه در محیط TSI هم قسمت سطحی و هم عمقی اسیدی (زرد) می شود. از روی محیط KIA می توان مجددا تست آگلوتیناسیون را تکرار نمود.

11. متداولترین محیطهای کشت
محیط کشت اختصاصی منصور TTC (توروکولات- تلوریت- ژلاتین آگار) در PH=8.5 فعال است و پس از 24 ساعت گرمخانه گذاری کلنی های خاکستری سیاه ایجاد می شود.
محیط کشت Aronson حاوی سوکروز، دکستروز و آبگوشت است که پس از 24 ساعت گرمخانه گذاری کلنی قرمز براق ایجاد می کند

12. فلوچارت تشخیص ویبریو کلرا از نمونه

13. تشخیص ویبریوکلرا بایوتایپ التور
بعد از تشخیص به عنوان ویبریوکلرا O1 ، برای تشخیص بیوتیپ Eltor از بایوتایپ کلاسیک ویبریوکلرا، از آزمایشات زیر مورد استفاده قرار می گیرد.
کلاسیک
التور
تست VP - +
حساسیت به پلی میکسینB
حساس
مقاوم
همولیز

14. تعیین بایوتایپ و سرو تایپ های ویبریو کلرا کلاسیک و التور

15. آزمایشات دیگرجهت تشخیص ویبریوکلرا
اکسیداز: مثبت
کاتالاز: مثبت
String test: توسط دزاکسی کولات سدیم 0.5% : مثبت
مشاهده حرکت نیزه ای باکتری در زیر میکروسکوپ
استفاده از محیط های کشت افتراقی
TSI: Acid/Acid
Urea: (-)
KIA: Alk/Acid
Gelatin hydrolysis :(+)
LiA: Alk/Alk
Motility :(+)
SH2 :(-)
Phenyl alanin deaminase: (-)
Indole: (+)
VP: (+/-)
MR: (-)
حساسیت به (+): O/129

16. Non O1(NAG)
درصورتیکه کلنی های مشکوک با آنتی سرم O1 واکنش ندادند و دارای خصوصیات ذیل بودند ویبریوکلراNon O1(NAG) گزارش می شود.
1-باسیل های گرم منفی متحرک
2- اکسیداز: (+)
3-محیط Alk/Acid:KIA
4 -اندول: (+)
5- کاتالاز: (+)
6- اورآز : (-)
7-واکنش با آنتی سرم فلاژل H: مثبت

17. آئروموناس
آئروموناسها از خانواده ویبریوناسه به خانواده جدید آئروموناداسیه منتقل شده اند.
باسیلهای گرم منفی هستند که بصورت گسترده در طبیعت منتشرند. در آبهای تازه و گاهی در حیوانات خونسرد یافت می شوند.
در انسان باعث اسهال می شوند.
آئروموناس ها از طریق واکنش مثبت اکسیداز به روی کلنی های رشد یافته باکتری به روی محیط بلاد آگار از باسیل های گرم منفی روده ای افتراق داده می شوند.
بر اساس مقاومت به ترکیب O/129 و رشد نکردن روی محیطهای حاوی 6% نمک طعام از ویبریوها افتراق داده می شوند.
آزمایشات دیگری که در تشخیص آزمایشگاهی :
(-): LIA
آرژینین دکربوکسیلاز:(+)
اورنیتین دکربوکسیلاز :(-)

18. آئروموناس

19. پلزیوموناس
پلزیوموناس در طبیعت یافت می شوند ، در حیوانات خونگرم و خونسرد دیده می شوند.
ندرتا باعث اسهال می شوند. پلزیوموناس شیگلوئیدس باسیل گرم منفی دارای فلاژل قطبی است.
پلزیوموناس ها در نواحی حاره ای و تحت حاره ای شایع اند و از ماهی های آبهای تازه و بسیاری از حیوانات جدا می شوند.
بیشتر از کشتهای مدفوعی بیماران اسهالی جدا شده اند.
بعضی از سویه ها دارای آنتی ژنهای مشترکی با شیگلا سونه ای بوده و واکنش متقاطع با آنتی سرم شیگلا دارد.
توسط تست اکسیداز از شیگلا قابل افتراق است.
پلزیوموناس اکسیداز مثبت است.
چون DNase مثبت است از آئروموناس ها قابل افتراق است.

20. صفات اختصاصی ویبریو،آئروموناس و پلزیوموناس
صفات ویژه
ویبریو
آئروموناس
پلزیوموناس
اکسیداز +
حساسیت به O/ میکرو گرم
+/- -
حساسیت به O/ میکروگرم
تخمیر گلوکز
تخمیراینوزیتول
تخمیر مانیتول
ذوب ژلاتین
رشد در TCBS
رشد در Nacl 5/6 %

21. یرسینیا
باسیلهای گرم منفی پلئومورفیک کوتاهی هستند که ممکن است بصورت دو قطبی رنگ شوند.
این باکتریها کاتالاز مثبت و اکسیداز منفی هستند.
میکروآئروفیل یا بی هوازی اختیاری هستند.
اغلب حیوانات به عنوان میزبان طبیعی آنها محسوب می شوند. اما می تواند در انسان ها بیماری های شدید ایجاد کند.
این جنس شامل یرسینیاپستیس، یرسینیا سودوتوبرکلوزیس و یرسینیا انتروکولیتیکا است.

22. یرسینیا پستیس
عامل بیماری طاعون است که بصورت طاعون خیارکی ، طاعون پنومونی و طاعون سپتی سمی دیده می شود.
یرسینیا پستیس باسیل گرم منفی کوچک (بصورت کوکوباسیل کوتاه بیضی به شکل سنجاق قفلی شکل است که در کشت کهنه به صورت پلی مورفیک (دراز، بزرگ، نامنظم) دیده می شود.
این باکتری در نمونه اولیه کپسول داراست و (کپسول در 37 درجه مشخص تر از 27 درجه است) و در کشت بدون کپسول دیده می شود.
یرسینیا پستیس بدون حرکت و بدون اسپور است. این باکتری بی هوازی اختیاری است.

23. رنگ آمیزی رنگ آمیزی گرم متیلن بلو Wayson
همچنین از رنگ آمیزی آنتی بادی فلور سنت نیز جهت مشاهده استفاده می شود.

24. Wayson staining
a) Solution A Basic fuchsin g Methylene blue g Ethanol (95%) ml Mix together and filter through Whatman no.1 paper or equivalent. b) Solution B Phenol (aqueous) …. 5.0 ml Distilled water ml
Mix solution A with solution B. Store at ambient room temperature in a dark glass bottle for 5 years.
Prepare a thin smear or impression touch-preparation on a slide heat-fix the smear
Flood the smear with stain, leave on for only 5-10 seconds
Wash the slide in tap water. Let the stained smear air dry.
Examine the slide under light microscope by using a high-power or oil immersion objective for adequate magnification
Consistent, striking bipolar safety-pin morphology of plump bacilli is characteristic of Yersinia, Bipolar appearance is not unique to Y. pestis.

25. تشخیص آزمایشگاهی یرسینیا پستیس
شناسایی بیماری طاعون با یافتن یرسینیا پستیس در مایع حاصل از غدد لنفاوی در بیماران مبتلا به طاعون خیارکی یا در خلط بیماران مبتلا به طاعون پنومونی انجام می گیرد
در طاعون خیارکی از غدد لنفاوی بوسیله سرنگ نمونه تهیه می شود.

26. لام تهیه شده به طریق گرم و متیلن بلو رنگ آمیزی شده و مشاهده می گردد.

27. تشخیص آزمایشگاهی یرسینیا پستیس
کشت روی بلاد آگار انجام می شود . در دمای 30 درجه سانتیگراد باکتری دارای بیشترین سرعت رشد است.
کلنی 24 ساعته در 32 درجه سانتیگراد ممکن است بسیار ریز باشد.
کلنی های مایل به خاکستری و کش دار می باشند که بعد از پاساژ در آزمایشگاه نامنظم و خشن می شوند
یرسینیاپستیس در محیط مک کانکی حاوی املاح صفراوی نیز رشد می کند
نمونه حیوانات آزمایشگاهی مانند خوکچه هندی و موشهای سفید تلقیح می گردد.

28. طاعون پنومونی:
لام تهیه شده از خلط بروشهای گرام و متیلن بلو رنگ آمیزی شده و باسیلهای دو قطبی مشاهده می گردد.
برای کشت خالص نیز همانگونه که برای طاعون خیارکی گفته شده، نمونه کشت داده می شود.
تمام کشتها دارای خاصیت بیماریزایی بسیار زیاد بوده و هنگام کار کردن باید دقت کافی به عمل آورد.
برای تشخیص عفونت قبلی، سرم بیماران را توسط تست ثبوت کمپلمان یا تست هم آگلوتینیشن با گلبولهای قرمز گوسفند که آنتی ژن F1 کپسول را جذب کرده است مورد بررسی قرار می دهند.

29. یرسینیا سودوتوبرکلوزیس
یک بیماری مشترک بین انسان و حیوان را ایجاد کرده که از طریق تماس پوست با آب آلوده یا مصرف سبزیجات با غذاهای آلوده به انسان سرایت می کند.
گاهی باعث التهاب غدد لنفاوی مزانتر شبیه به آپاندیسیت حاد و یا نیمه حاد در مردان جوان منجر می شود.
انتریت (التهاب روده) بندرت توسط این باکتری ایجاد می شود.

30. تشخیص آزمایشگاهی یرسینیا سودوتوبرکلوزیس
نمونه از غدد لنفاوی مزانتر تهیه شده و در محیط های نوترینت آگار، بلاد آگار و مک کانکی کشت داده می شود.
در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 18 ساعت نگهداری می شود. کلنی های این باکتری به صورت دانه دار، شفاف یا سطح خرد شده، مسی دیده می شوند.
در بلادآگار بدون همولیز بوده و در مک کانکی رشد ضعیفی دارد. این باکتری در 25 درجه دارای تحرک ولی در 30 درجه بی حرکت است.
گسترش تهیه شده از کلنی بروشهای گرم، متیلن بلو و ذیل- نیلسن رنگ آمیزی می شود. در رنگ آمیزی باسیلهای کوچک بیضی دو قطبی مشاهده می گردد.
این باکتری کمی اسید فست است ( نتایج آزمایشات تشخیص بعدی در جدول آمده است).
تستهای آگلوتیناسیون را می توان با استفاده از محلولهای صاف و زنده و غیر فعال در اتانول و فرمالدئید از 6 سروتایپ یرسینیا سودوتوبرکلوزیس که در 22 درجه سانتیگراد رشد کرده انجام داد. لوله ها بعد از نگهداری در 52 درجه سانتیگراد بعد از 4 تا 24 ساعت مورد بررسی قرار می دهند.

31. یرسینیا انتروکولیتیکا
عامل انتروکولیت (اسهالی مانند شیگلوز) است
از جوندگان و حیوانات اهلی( بخصوص گوسفند، گاو، خوک، سگ و گربه ها)و از آبهای آلوده شده و انتقال به انسانها احتمالا از طریق آلوده شدن غذا، نوشیدنی ها و وسایل انجام می شود.
عفونت انسانی احتمالا ناشی از خوردن مواد آلوده شده به مدفوع حیوانی است.
بیشتر انواع یرسینیا انتروکلیتیکا که در انسان بیماریزا هستند مربوط به سروتایپ های O9,O8,O7 است که سروتیپ O9در عفونتهای انسانی غالب است.
بسیاری از خصوصیات باکتری در درجه سانتیگراد مثبت و در 37 درجه منفی است.

32. تشخیص آزمایشگاهی یرسینیا انتروکولیتیکا
نمونه های مورد آزمایش معمولا مدفوع و خون است.
جهت رنگ آمیزی نمونه بروشهای گرم و متیلن بلو رنگ آمیزی کرده و باکتریهای بیضی شکل دو قطبی مشاهده می گردد.
کشت: نمونه بروی نوترینت آگار، بلاد آگار و مک کانکی کشت داده می شود که در مک کانکی رشد ضعیفی دارد. کشت بروی EMB توصیه نمی شود

33. تشخیص آزمایشگاهی یرسینیا انتروکولیتیکا
محیط کشت اختصاصی باکتری CINagar (سفسولودین- ایرگاسان، نووبیوسین آگار) حاوی نمک صفراوی و کریستال ویوله است که در این محیط بعد از 24 ساعت گرمخانه گذاری در 37 درجه سانتیگراد کلنی های دانه دار در وسط برنگ قرمز با اطراف کم رنگ (کلنی های چشم گاوی ) ایجاد می شود.

34. تشخیص آزمایشگاهی یرسینیا انتروکولیتیکا
بهترین رشد این باکتری در 25 درجه سانتیگراد است.
در 25 درجه متحرک و در 37 درجه سانتیگراد بدون حرکت است.

35. تشخیص آزمایشگاهی یرسینیا انتروکولیتیکا
یرسینیا انتروکولیتیکا سوکروز را تخمیر می کند. لذا در محیط TSI بصورت Acid/Acid و در محیط KIA ALK/Acid دیده می شود.
نام تست
Y.pestis
Y.enterocolytica
Y.pseudotuberclusis
اندول - d MR +
VP در 25 درجه سانتی گراد
VP در 37 درجه سانتی گراد
حرکت در 25 درجه سانتیگراد
حرکت در 37 درجه سانتی گراد
اوره آز
فنیل الانین دآمیناز
اورنیتین دکربوکسیلاز
تخمیر لاکتوز
تخمیر سوکروز
KIA
Alk/Acid
Alk/acid
TSI
Acid/acid

36. تشخیص آزمایشگاهی یرسینیا انتروکولیتیکا
تست اوره از: مثبت
LIA
محیط MRVP: سمت راست در 37 درجه(-) و سمت چپ در 25 درجه(+)

37. Cold Enrichment method
بدین ترتیب که مقدار کمی از مدفوع با سواب برداشته شده از مقعد را در بافر6.7 PH= گذاشته و در حرارت 4 درجه سانتیگراد به مدت 2 تا 3 هفته نگهداری می کنند. اکثر میکروارگانیسم ها در این دما از بین رفته و فقط این باکتری تکثیر می یابد. برای بدست آوردن یرسینیا، کشت بعدی در فواصل زمانی در محیط مک کانکی انجام می شود.