1. Biofizikalne osnove svjetlosne i elektronske mikrokopije
Prof. dr. sc. Dario Faj

2. Mikroskop

3. Mikroskopija
Osnovna zadaća – stvaranje slike s povećanom rezolucijom (razlučivanjem)
Razlučivanje – mogućnost razlikovanja detalja
Snaga razlučivanja (RP) – najmanja udaljenost dva detalja u objektu koji se mogu razlikovati

4. Rezolucija oka
Vidni kut zatvaraju svjetlosne zrake koje s krajeva predmeta dolaze u oko i stvaraju sliku
Razlučivanje određeno vidnim kutom
Može se izračunati RP ≈ 50 µm na DJV
Sferne i kromatične aberacije smanjuju snagu rezolucije ≈ 100 µm na DJV

5. Optički instrumenti - Lupa
Povećavamo vidni kut promatranja

6. Optički instrumenti - mikroskop
objektiv daje realnu uvećanu sliku i određuje rezoluciju mikroskopa
okular djeluje kao lupa i stvara virtualnu sliku na 25 cm od oka
kutno povećanje mikroskopa

7. Ograničenje razlučenja – pinhole camera
Udaljavamo film => beskonačno veliko razlučivanje????
Problem 1: velika rupa
Problem 2: svjetlost ima valna svojstva

8. Svjetlost – EM val Promjena brzine u sredstvu => promjena smjera
Fokusirane svjetlosne zrake ne čine točku:

9. Valna svojstva – ogib (difrakcija)

10. Valna svojstva – interferencija

11. Interferencija Jednak put: Konstruktivna
λ/2 razlika puta: Destruktivna

12. Mikroskop: valna optika
Raspodjela svjetlosti u
Ravnini slike: TOČKA?
NE. Point spread function:

13. Slika točke u lateralnoj ravnini
PSF ima središnji disk (Airy).
Prvi tamni disk ima polumjer:
r=0.61 λ/NA
Normalna
Uvećana

14. Numerička apertura
Otvorni kut objektiva tvore zrake koje još sudjeluju u stvaranju slike (idu rubovima leće)
Veći otvorni kut objektiva: sferni valovi udaljeniji => bolje razlučivanje

15. Efekt numeričke aperture na sliku (PSF)
Valovi koji još uvijek čine sliku su udaljeniji za veliki NA, rezultat je uža središnja slika objekta.

16. Uporaba imerzijskog sredstva
imerzijsko sredstvo između objektiva i preparata smanjuje otklon zraka svjetlosti iz preparata pa povećava rezoluciju

17. Numerička apertura

18. Slika točke u lateralnoj ravnini
PSF ima središnji disk (Airy).
Prvi tamni disk ima polumjer:
r=0.61 λ/NA
Normalna
Uvećana
Uz, NA=1.4 i λ=480nm => r=225 nm
RAYLEIGHOV KRITERIJ: RP=r

19. Kada možemo reći da se radi o dva objekta? (Rayleigh kriterij)

20. Nema razlike u povećanju samo NA
Korisno povećanje=rezolucija oka na 25 cm/rezolucija mikroskopa= 100µm/200nm=500

21. Ograničenje rezolucije, supermikroskopija vs konvenc
Ograničenje rezolucije, supermikroskopija vs konvenc. epifluorosc (z os prikazana bojom)

22. Koja struktura nas zanima?

23. Posebni optički mikroskopi – povećanje kontrasta
kvaliteta slike ovisi o rezoluciji i kontrastu (razlikovanje na temelju različitosti intenziteta propuštene svjetlosti)
biološki preparati su disperzni sistemi u vodi – kontrast je vrlo slab
poboljšanje:
1. bojenje dijelova preparata (amplitudni preparat)
2. razlika optičkih putova uzrokuje razliku faza (fazni
preparat) – pretvara se u razliku intenziteta
3. uzrokovani fazni pomak ogibnih snopova - različite
osvjetljenosti preparata i pozadine
4. primjena fluorescencije (prirodne i izazvane)
- konfokalni mikroskop

24. Interferencijski mikroskop
broj valova na putu L je različit u otapalu i preparatu:
razlika faza izlaznih valova
tu razliku faza pretvaramo u razliku intenziteta - interferencija valova koji prolaze kroz preparat i onih koji prolaze oko njega
not 1 1 l0 l
npr 2 2 l’ L

25. Primjer: Detalj s većim indeksom loma od okoline
Oko ne vidi razliku u fazi.

26. Izvedba interferencijskog mikroskopa
snop koji ne prolazi
kroz preparat
snop kroz
preparat

27. jajašca i spermiji morske alge snimljeni interferencijskim mikroskopom

28. Fazno-kontrastni mikroskop
konični snop zraka ogiba se na preparatu i na leći
fazna pločica u stražnjoj žarišnoj ravnini objektiva pomiče razliku faza 0-tog i ostalih ogibnih maksimuma s l/4 na l/2
zbog destruktivne interferencije slika preparata je tamna
strukture unutar preparata zbog dodatne razlike faza dobro se uočavaju
fazni
prsten
ogibni maksm.
objektiv
uzorak
kondenzor

29. Mikroorganizmi snimljeni fazno- kontrastnim mikroskopom
bakterije
protozoe

30. Usporedba kontrasta za ‘klasični’ i fazno kontrastni mikroskop

31. Mikroskopi koji koriste fluoroscenciju
Jedna od najbrže rastućih metoda
Koriste svjetlost proizvedenu u uzorku
Vrlo osjetljivi (50 fluoroscentnih molekula po mikronu)
Puno out-of-fokus svijetlosti
Jablonski dijagram fluoros

32. GFP (green fluorescent protein) se vezuje na receptore za glukagon
Jezgre bubrežnih
stanica embrija -
plava boja se
vezala na DNA
endosomi (crveno),
GFP-receptor (zeleno)
nakon tretmana bubrežnih
stanica, receptor iz membrane
migrira u citoplazmu
hepatokarcinoma stanice
snimila Lada Krilov

33. Konfokalni fluorescentni mikroskop (pretraživački; laserski snop)
laserski snop se fokusira na malo područje
uzorak je fluorescentan
reflektirana i fluorescentna svjetlost se razdvajaju zrcalom
apertura ispred detektora propušta fluorescentnu svjetlost samo iz dijela uzorka u ravnini žarišta objektiva
mogućnost rekonstrukcije 3D slike

34. Optički put u konfokalnom pretraživačkom fluoroscentnom mikroskopu

35. Detektor (fotomultiplikator)
Mora biti brz (konfokalni snop nekoliko µs za pixel)

36. ‘Konvencionalni – konfokalni’
Zamagljena slika jer mikroskop ‘vidi’ svjetlost koja dolazi iz ravnine fokusa, ali i onu koja ne dolazi iz te ravnine
Blokira svjetlost koja ne dolazi iz ravnine fokusa – omogućuje 3D rekonstrukciju

37. bubrežne stanice embrija tretirane glukagonom (glukagonski receptor fluorescira zeleno)
snimila Lada Krilov

38. Nedostatci konfokalnog mikroskopa
Loša efikasnost prikupljanja svijetla (fotomultiplikator je brz, ali prikupi oko 25% fotona i pretvori u elektron)
Spor – snima točku po točku (1µs za točku - 1Mpixel? ≈ 1s)
Teško je snimati funkcionalnost ako se nešto događa brzo
RJEŠENJE: Koristiti više apertura i detektora

39. Spinning disc confocal
Koristi puno apertura odjednom => toliko je brz da se može koristiti CCD kao detektor

40. Kada koristiti konfokalni mikroskop?
Fiksirani uzorci:
Tanki uzorci – ‘konvencionalni mikroskop’
Uzorci debljine do 100 µm – konfokalni
Preko 100 µm, previše out-of-fokus svjetlosti => specijalizirani mikroskopi (npr. dvofotonski)
Živi uzorci
Dodatno voditi računa o preživljenju uzorka tijekom obasjavanja laserom

42. Elektronski mikroskop
Rayleighov kriterij – glavno ograničenje svjetlosne mikroskopije
r=0.61 λ/NA
Jedino rješenje smanjiti valnu duljinu
=> x-zrake?
De Brogli, valna svojstva elektrona (λ=h/mv) ubrzanih u električnom polju:
Ek=(mv2)/2 = e U

44. Elektronski mikroskop
Heisenbergova relacija neodređenosti?

45. Specimen interaction is what makes Electron Microscopy possible.
The energetic electrons in the microscope strike the sample and various reactions can occur as shown below.
The reactions noted on the top side of the diagram are utilized when examining thick or bulk specimens (SEM) while the reactions on the bottom side are those examined in thin or foil specimens (TEM).

46. Izvedba TEM mikroskopa
Snop iz katode
Ubrzanje do cca 100 kV
Vakuum
Leće – magnetska polja koja usmjeravaju elektrone
U stvaranju slike sudjeluju elektroni raspršeni na atomima
Raspršenje na težim atomima veće (bolji kontrast) – biološki materijali imaju mali kontrast
Priprema preparata: zamrznut, reže se na tanke slojeve ( do 100 nm) da ne dođe do apsorpcije elektrona, bojanje teškim atoma radi boljeg kontrasta, radi osiguranja mehaničke stabilnosti preparat se smješta na nosač (srebrna mrežica)
top
magnetske leće
uzorak
elektroni
slika
vakuum
kamera

47. Nosač preparata

48. TEM – presjek stanice

49. Tanki uzorak alge obojan teškim metalima (Ur, Pb)

50. Tanki nanokristal silicija EM
Stanica pod EM
Tanki nanokristal silicija EM
Biološki materijal: vakuum, loš kontrast, osjetljiv na zračenje

51. Može i brzo zamrzavanje (uzorak hidratiziran)

52. Prikupljanje i analiza TEM slika
Samo 2D slike
Za biološke uzorke malo elektrona na površini
Usrednjavanje niza slika iste projekcije
3D (CT)

53. Pretraživački elektronski mikroskop - SEM
lošija rezolucija,dmin= 5-10 nm, usporediva s dimenzijom upadnog elektronskog snopa
3D kvaliteta slike dobiva se upotrebom struje sekundarnih elektrona kojom moduliramo ‘osvjetljenost’ slike
top
leće
plankton
uzorak detektor
pumpa

54. SEM

55. “Scanning tunneling” mikroskop (STM)
Prikazuje se morfologija površine uzorka
Izvor elektrona je mikrovršak pod naponom od nekoliko V
Piramida wolframovih atoma
Tunel efekt – struja tunelirajućih elektrona proporcionalna s udaljenošću vrška od površine uzorka.
Konzola vrlo osjetljiva na pokret šiljka

56. “Scanning tunneling” mikroskop (STM)
kad je proba vrlo blizu površine javlja se struja tuneliranja, It koja se detektira
varijacijom položaja probe tako da se It održava konstantna, dobiva se reljef površine - vizualizacija pojedinačnih atoma
potreban je vodljiv uzorak – ograničena biološka primjena na uzorke koji se mogu obložiti ugljikom ili platinom

57. “Atomic force” mikroskop (AFM)
između vrha probe i uzorka djeluju privlačne Van der Waalsove sile koje primiču konzolu uzorku
na velikoj blizini, odbojne sile savijaju konzolu unatrag
registracija - preko reflektiranih laserskih snopova koji padaju na niz fotoćelija
mjerenje sile vezivanja, na pr. ligand-receptor

58. SEM
SEM
TEM
TEM
Neuroni
Stanične organele

60. Elektronski mikroskop
Elektronski mikroskop popunjava prazninu od 1 µm (optički mikroskop) do 1 nm (rendgenska difrakcija)