1. Selección de SNPs en xenética médica
Javier Costas
Hospital Clínico Universitario

2. O Proxecto Xenoma Humano
Orixe nos 80
Unha visión global dos xenomas podería acelerar significativamente a investigación biomédica
A dimensión do proxecto exixiría un esforzo comunitario de grande envergadura

3. O Proxecto Xenoma Humano
Grande desenvolvemento tecnolóxico
Primeiro borrador da secuencia do xenoma humano: febreiro 2001

4. O Proxecto Xenoma Humano
Principais logros iniciais
3 x 109 bp
Identificación de xenes (~22500 xenes)
Identificación de marcadores moleculares, microsatélites e SNPs (>1’4 millones)
Mapa físico do xenoma

5. Marcadores moleculares
Microsatélites (Simple tandem repeats, STRs)
Repeticións de secuencias cortas
ACTT CGT CGT CGT CGT CGT CAAT
Moi variables
SNPs (Single nucleotide polymorphisms)
Cambios dun único nucleótido (frecuencia > 1%)
AAG T TACG
AAG A TACG
Moi abundantes (1 SNP/300 bp)
Doados de analizar a grande escala

6. Haplotipos Xenotipo AA(CTT)5,7ACT...CGC(C/T)CAA...CAC(A/T)TG...
Cromosoma 1 AA(CTT)7ACT...CGCTCAA...CACTTG...
Cromosoma 2 AA(CTT)5ACT...CGCCCAA...CACATG...
Haplotipo 1 (CTT)7TT
Haplotipo 2 (CTT)5CA

7. Enfermedades mendelianas
Debidas a mutacións nun único xene
Pouco frecuentes
Ex: Distrofia muscular de Duchenne, -talasemia, hemofilia, fenilcetonuria, fibose cística...
OLLO!
The methods of lod score analysis described in this chapter require a precise genetic model that specifies the mode of inheritance, gene frequencies and penetrance of each genotype

8. Human Gene Mutation Database
45875 mutacións en 1800 xenes asociados con enfermedades
1745 descripcións fenotípicas con base molecular coñecida

9. Mapeo xenético de enfermedades mendelianas
Cosegregación de marcador e enfermedade: ligamento en familias
Haravuori et al. Am. J. Hum. Genet., 62: , 1998

10. Enfermedades multifactoriais complexas
Alto risco de enfermedade
Factores xenéticos de risco
Factores ambientais de risco
Factores xenéticos de protección
Factores ambientais de protección
Baixo risco de enfermedade
Interaccións xene-xene e xene-ambiente

11. Enfermedades Mendelianas vs enfermedades complexas
Único xene
Raras
Estudos de ligamento en familias
Exemplo: distrofia muscular (DMD), hemofilia, fibrose cística...
Múltiples xenes e/ou ambiente
Comúns
Estudos de asociación en poboacións
Exemplos: asma, artrite, cancro, hipertensión, trastorno bipolar...

12. Estudos de asociación
Diferencia significativa en distribución de SNPs en casos e controles
Muestreo mais simple que métodos baseados en familias
Mais potencia que estudos de ligamento en familias no caso de riscos relativos pequenos

13. Asociación frente a ligamento
Estudos de ligamento
en familias
Magnitude do efecto
Estudos de asociación
en poboacións
Frecuencia na poboación

14. Hipótese enfermedade común/variante común
Estudos de asociación
Hipótese enfermedade común/variante común
O risco xenético a padecer enfermedades comúns é xeralmente debido a alelos de predisposición que segregan a frecuencias relativamente elevadas na poboación (Lander, Science 1996)
Ex: ApoE4 e Alzheimer: Frec: ~15%, OR: 3’3, GRR-homoz:12

15. Selección de SNPs Localización (xenes candidato) Validación Frecuencia
Secuencia
Tipo de SNP (método de asociación)
dbSNP (NCBI)

16. dbSNP

17. Selección de SNPs Localización (xenes candidato) Validación Frecuencia
Secuencia
Tipo de SNP (método de asociación)

18. Selección xenes candidato
Xenes candidato funcionais (función, expresión, interaccións)
Xenes candidato posicionais (ligamento)

20. > 4800 revistas biomédicas
Base bibliográfica:
> 4800 revistas biomédicas
> 15 millones de referencias

21. Gene Ontology
Vocabulario común para a descripción estructural de funcións protéicas en diferentes organismos  organismos modelo
Actualmente, más de termos que describen función molecular, proceso biolóxico, localización celular

22. Ex.1: enfermedades autoinmunes, artrite reumatoide
Artritis reumatoide

23. Ex.2: farmacoxenética
Farmacogenética

24. Rutas metabólicas 100 rutas 300 rutas Listado de vías metabólicas
Búsqueda por xene, enzima, composto o combinación de 2

25. Ruta de sinalización de NF-kB
                                                                                      

27. Selección de SNPs Localización (xenes candidato) Validación Frecuencia
Secuencia
Tipo de SNP (método de asociación)

28. dbSNP
Validación

29. dbSNP

30. Selección de SNPs Localización (xenes candidato) Validación Frecuencia
Secuencia
Tipo de SNP (método de asociación)

31. Distribución de frecuencias de SNPs
Proporción de polimorfismos
Frecuencia do alelo menor

32. Efecto da frecuencia sobre a potencia dun estudo de asociación caso-control
Risco relativo = 2

33. Diferencias de frecuencias entre poboacións
Cambios nas frecuencias xénicas (resultado de mutación, deriva xenética, selección e migración)
Hipótese “Out-of-Africa”

34. Diferencias de frecuencias entre poboacións
Colonización paleolítica
Dispersión paleolítica post-glaciación
Dispersión Neolítica

35. Selección de SNPs Localización (xenes candidato) Validación Frecuencia
Secuencia
Tipo de SNP (método de asociación)

36. Secuencia en torno ao SNP
Depende do método de xenotipación (PCR)
Non repetitiva
SNPs secundarios

37. Selección de SNPs Localización (xenes candidato) Validación Frecuencia
Secuencia
Tipo de SNP (método de asociación)

38. Estudos de asociación Método directo: SNPs funcionais (causais) T C
Método indirecto: mapeo por desequilibrio de ligamento (LD) LD LD A T A C C T

39. Selección de SNPs funcionais
SNPs codificantes non sinónimos ou sen senso
SNPs que afecten ao “splicing”
SNPs en posibles sitios de unión de factores de transcripción (TFBS)
SNPs en rexións conservadas

40. SNPs codificantes non sinónimos ou sen senso
Código xenético

41. SNPs que afecten ao “splicing”

42. SNPs en posibles sitios de unión de factores de transcripción
Rexión promotora
Sitios de unión de factores de transcripción (TFBS)
Secuencias curtas
Pouco específicas
Diferente afinidade e especificidade
Difíciles de predecir (non existe equivalente ao código xenético das rexións codificantes)

43. SNPs en posibles sitios de unión de factores de transcripción

44. SNPs en posibles sitios de unión de factores de transcripción
Predicción de TFBS
Secuencias consenso: WAACCCTTT
Matrices de posicións ponderadas (Positional weight matrices)

45. SNPs en posibles sitios de unión de factores de transcripción
Identificación de TFBS mediante matrices de posicións ponderadas
1) Colección de TFBS coñecidos
2) Xeneración de matrices do aliñamento A C G T
3) Transformación a PWM baseado nas probabilidades a priori A C G T
Frecuenciaij
Pesoij ~ ln
Probabilidadei

46. SNPs en rexións conservadas
Se as secuencias non son funcionais  acumulación de mutacións co tempo  diverxencia
Se son funcionais  selección eliminando mutacións  conservación de secuencias
Comparación humano-rato: 5% do xenoma conservado
Ex: 1Mb cr11

47. SNPs en rexións conservadas

48. SNPs en rexións conservadas

49. Obxectivo: identificación de tódalas secuencias funcionais do xenoma humano

50. Rexións escollidas na fase inicial: 30Mb, 1%
50% escollidas manualmente:
- Xenes (o outros) ben coñecidos
- Datos comparativos
 14 rexións, 0,5-2Mb
50% escollidas ao longo do xenoma en función da densidade xénica e conservación de rexións non-exónicas
 30 rexións de 500 Kb

51. Estudos de asociación Método directo: SNPs funcionais (causais) T C
Método indirecto: mapeo por desequilibrio de ligamento (LD) LD LD A T A C C T

52. Desequilibrio de ligamiento (LD)
Presencia conxunta de dous alelos próximos a unha frecuencia significativamente distinta á esperada en función das súas frecuencias individuais
Xene 2
Xene 1
Problema: depende das frecuencias
D’ = D/Dmax , –1< D’<1
r2 = D2/fA.fa.fB.fb, 0<r2<1

53. Orixe do LD ...AACATCTG...ACCTGCCTTA...CCTGTACT...
...AACATCTG...ACCTGCCTTA...CCTGCACT...
...AACTTCTG...ACCTGCCTTA...CCTGCACT...
...AACTTCTG...ACCTGCCTTA...CCTGTACT...
...AACATCTG...ACCTGCCTTA...CCTGTACT...
...AACATCTG...ACCTGCCTTA...CCTGCACT...
...AACTTCTG...ACCCGCCTTA...CCTGTACT...
...AACTTCTG...ACCTGCCTTA...CCTGTACT...
A T T
A T C
T C T
T T T
Haplotipos
Desequilibrio de ligamento (LD)

54. Mapeo por desequilibrio de ligamento (LD)
Non precisa coñecemento previo sobre a funcionalidade do SNP
Menor potencia que o método directo, a non ser que o LD sexa perfecto LD LD LD T A C C T A
50%
50% 0%
50%
40%
10%

56. Bloques haplotípicos
Rexións do xenoma humano con baixa diversidade haplotípica e alto LD
Definición:
Diversidade haplotípica LD
Test dos 4 gametos ( recombinación)
ACCT ACCT
GCCT GCCT
GCCC

57. Bloques haplotípicos: LD

58. Bloques haplotípicos Haplotipos > 1% Haplotipos > 5% Bloque 2
Se hai recombinación: 2N = 512 haplotipos
Sen recombinación: N +1 = 10 haplotipos

59. Bloques haplotípicos: tagSNPs
Haplotipos > 5%
tagSNPs
Identificación de bloques haplotípicos
Selección dun subconxunto de SNPs que identifiquen os distintos haplotipos a frecuencias superiores a un mínimo establecido (5%, 10%)

60. “LD bins”
Conxunto de SNPs, non necesariamente consecutivos, que presentan unha r2 elevada entre eles
1 tagSNP/LD bin

61. Selección SNPs para mapeo por LD: LD útil
O incremento do tamaño muestral preciso para manter a potencia nun estudo de asociación caso-control é inversamente proporcional a r2
Ex.: Se se precisan 1000 casos/controles asumindo que xenotipamos o SNP causal, precisaranse 2000 casos/controles usando un marcador con r2 = 0’5

62. Xapón, Reino Unido, Canadá, China, EE.UU., Nixeria
International HapMap Project
Orixe no 2001
Xapón, Reino Unido, Canadá, China, EE.UU., Nixeria
Describir os patróns comúns de variación humana
Desenvolver un mapa haplotípico do xenoma humano
Información disponible públicamente
Densidade mínima 1 SNP/ 5 Kb
Identificar SNPs distintivos (tagSNPs)

63. Mostras de 4 poboacións representativas:
International HapMap Project
Mostras de 4 poboacións representativas:
CEU: 30 tríos de residentes en Utah con ascendencia no norte e oeste de Europa (Centre d'Etude du Polymorphisme Humain, 1980)
CHB: 45 chinos Han de Pekín
JPT: 45 xaponeses de Tokio
YRI: 30 tríos de Yoruba de Ibadan (Nigeria)
Fase I finalizada
Fase II: incrementar densidade de SNPs nas rexións con pouco LD

64. International HapMap Project
Obxectivo final:
Facilitar o descubrimento de variantes de susceptibilidade a enfermedades comúns
Reducir o número de SNPs precisos para realizar estudos de asociación de todo o xenoma (whole-genome scans)

65. 71 individuos americanos de ascendencia europea, africana ou china
SNPs
71 individuos americanos de ascendencia europea, africana ou china
Disponible públicamente