1. ĢENĒTISKI MODIFICĒTĀ PĀRTIKA
Veselības zinātņu maģistra studiju programma uzturzinātnē
Studiju kurss: Jaunā un ģenētiski modificētā pārtika
ĢENĒTISKI MODIFICĒTĀ PĀRTIKA
INDRIĶIS MUIŽNIEKS, Rīga, gada jūnijs

2. ĢENĒTISKI MODIFICĒTI AUGI PĀRTIKĀ
Tēmu apgūstot paredzēts:
apgūt zināšanas par galvenajiem ģenētiskajiem elementiem, kurus izmanto ĢM augu ieguvē:
klonējamajiem gēniem, to kodētajām pazīmēm un izcelsmi,
izmantojamiem regulācijas elementiem un to darbības īpatnībām,
plašāk lietotajām vektorsistēmām,
augu šūnu transformācijas metodēm,
augu organismu reģenerācijas metodēm;
gūt izpratni par ĢM augu daudzveidību;
saņem informāciju par galvenajām ĢM augu grupām un izplatītākajām īpašībām, par bioķīmiskajiem mehānismiem, kuri nodrošina modifikāciju;
novērtēt ĢM augu izplatības dinamiku pasaules lauksaimniecībā pēdējo 10 gadu laikā;
novērtēt ĢM augu izmantošanas un sastopamības iespējas dažādos pārtikas produktos.

3. GĒNS - NUKLEOTĪDU SECĪBA, KAS KODĒ PROTEĪNA STRUKTŪRU
ĢENĒTISKĀS MODIFIKĀCIJAS MOLEKULĀRIE PAMATI
GĒNS - NUKLEOTĪDU SECĪBA,
KAS KODĒ PROTEĪNA STRUKTŪRU O P
KODĒJOŠĀ DAĻA T
GĒNA DARBĪBU REGULĒ:
P - promoters, nukleīnskābes rajons, kurā sākas gēna informācijas pārrakstīšana par mRNS
O - operators, nukleīnskābes rajons, kas regulē promotera aktivitāti
T - terminators, nukleīnskābes rajons, kurā tiek pārtraukta gēna transkripcija

4. Augu šūnas īpatnības:
šūnas siena; organellas; vakuolas; transporta signālsecības

5. Hloroplastu genoma izmēri - ~ 70 - ~ 220 k.b.p., vidēji 160 k.b.p.
Annals of Botany 103: 625–633, 2009

6. Augu mitohondriju genoma raksturojums
(dzīvnieku – 15 – 18 k.b.p., sēņu – 18 – 78 k.b.p.)
Gēnu plūsma no mitohondrijiem un hloroplastiem uz kodolu

7. Regulatori ĢM AUGA IEGŪŠANA Visā auga organismā aktīvie regulatori:
Promoteri: CaMV 35 S RNA; nopalīna, oktopīna, manopīna sintāžu (nos, ocs, mas ), ubikvitīna, aktīna. NOS-terminators,

8. Regulatori
CaMV: Cauliflower mosaic virus (puķkāpostu mozaīkas vīruss)
CaMV: 50 nm diametra kapsīds, ~ 8030 b.p. ds DNS ar vienpavediena pārrāvumiem, NS ~16% viriona masas.
Inficē Cruciferae, Resedaceae, Solanaceae augu dzimtas, pārnesēji - laputis

9. Regulatori
CaMV replikācija notiek līdzīgi cilvēka B tipa hepatīta vīrusam:
uz DNS matricas tiek sintezēta par genomu garāka 35 S RNS, kuru vīrusa revertāze atkal pārvērš DNS formā.

10. Promotera patenti pieder Monsanto un Rokfellera universitātei
Promotera patenti pieder Monsanto un Rokfellera universitātei

11. Regulatori
Ubikvitīns – visās eikariotu šūnās sastopams neliels (76 aminosk. atlikumi, 8564 Da) proteīns, ar kuru iezīmē proteosomās noārdīšanai paredzētos proteīnus
Patenti: Mycogen, Monsanto

12. Regulatori
Aktīns – visās eikariotu šūnās sastopams citoskeleta komponents, kas piedalās šūnas formas veidošanā, kustību un dalīšanās procesos

13. Regulatori
Alkoholdehidrogenāzes promotera inducējama sistēma. Citas inducējamas sistēmas – tet, glikokortikoīdu hormoni, metālu joni, vides stress, gaisma
Alcohol dehydrogenase I (Adh-I) encoded by the alc A gene;
transcriptional activator protein AlcR;
ethanol, ethyl methyl ketone or other alcohols/ketones act as inducers of the gene expression.
Patents - Syngenta

14. Regulatori Sēklu specifiski promoteri
Plant Biotechnology Journal (2010) 8, pp. 588–606

15. Regulatori
Agrobacterium inducētie sakņu audzēji
Agrobacterium Ti plazmīda
nos - nopalīna sintēzes gēna terminators no Agrobacterium Ti plazmīdas
Nopalīns
helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/crown.htm

16. Regulatori Nuclear Matrix Attachment Region (MAR)
un augu gēnu ekspresija.
MAR – kodolu strukturējošas proteīna fibrillas, ar kurām mijiedarbojas specifiskas DNS secības, piem., 1,2 kbp. RB7 MAR no tabakas sakņu specifiskā gēna 3’-flankējošā rajona.
MAR klātbūtnē ievērojami (~30 x) pieaug ekspresija no stipriem augu promoteriem (CaMV 35 S RNS, NOS, OCS), vājos promoterus ietekmē maz.
Gēnu klusināšanas parādību (silencing) novēršana.

17. Nesēji - vektorplazmīdas
Selekcionējamie marķiergēni - rezistences
kanamicīna vai G148 :
neomicīna fosfotransferāze (npt II),
higromicīns B : higromicīna fosfotransferāze (hyg B),
gentamicīns : gentamicīna acetiltransferāze,
streptomicīns :
streptomicīna fosfotransferāze,
- fosfinotricīns (basta, bioalofoss, glufosināts): fosfinotricīna acetiltransferāze (pat).

18. Nesēji - vektorplazmīdas
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Nesēji - vektorplazmīdas
Selekcionējamie marķiergēni – krāsa un gaisma
Reportiergēni dod iespēju tieši novērot gēnu ekspresijas vietu un laiku :
GUS (b-glukuronidāze),
GFP (zaļi fluoriscējošais proteīns), LUX (luciferāze).

19. Nesēji - vektorplazmīdas
Marķiergēna darbība audu specifiska promotera kontrolē
a-amilāzes promoters darbojas endospermā. ĢM rīsā tas kontrolē baktēriju izcelsmes reportiergēnu gus A. Zilā krāsa rodas, šķeļot sintētisku gus A substrātu, kurā iemērc dīgstošus rīsa graudus.

20. Nesēji - vektorplazmīdas
Pēc transgēna iegūšanas slekcijas marķierus vairs nevajag.
Selekcijas marķiera klātbūtne apgrūtina tālāko rīcību ar transgēnu.
Selekcijas marķieris (piem., antibiotiku rezistence) apgrūtina transgēna izmantošanu.
Transgēni augi bez selekcijas marķieriem.
Transformācija bez marķiera vai MAT vektori (multi-auto-transformation).

21. AUGU TRANSFORMĀCIJA ĢM AUGA IEGŪŠANA
Augu audu un veselu augu apstrāde makroinjekcija; mērcēšana; apstrāde ar baktērijām vakumā.
Protoplastu apstrāde PEG klātbūtnē; ar mākslīgajām liposomām; elektroporācija; sapludināšana.
Augu šūnu un šūnu kultūru apstrāde mikroinjekcija; balistiskā (biolistics) transformācija; agrobaktēriju metodes.

22. Augu transformācijas metodes
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Augu transformācijas metodes

23. Augu transformācijas metodes
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Augu transformācijas metodes
Apstrādājot ar celulāzēm un pektināzēm, iegūst augu protoplastus

24. Augu transformācijas metodes
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Augu transformācijas metodes
Balistiskā transformācija

25. Augu transformācijas metodes
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Augu transformācijas metodes
Balistiskā transformācija

26. Augu transformācijas metodes
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Augu transformācijas metodes
Agrobaktēriju sistēma
Arī dabā agrobaktērijas inficē augus un integrē to hromosomās savu genomu, veidojot t.s. “rētu audzējus” un “bārkšsaknes”.

27. Augu transformācijas metodes
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Augu transformācijas metodes
Agrobaktēriju sistēma

28. Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes
Transformācijas procesu regulē apm. 100 baktēriju gēni:
baktērijas piesasitīšanās pie auga šūnām (adhēzija);
plazmīdas pārnese;
plazmīdas nokļūšana šūnas kodolā (nuclear targeting);
integrācijas mērķa secību izvēle genomā.
Insercijas notiek transkripcionāli aktīvā hromatīnā.

29. Augu transformācijas metodes
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Augu transformācijas metodes
Agrobaktēriju sistēma

30. Augu transformācijas metodes
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Augu transformācijas metodes
no Escherichia coli
Agrobacterium divplazmīdu sistēma. Virulences plazmīda un klonējamo gēnu kasete

31. Augu transformācijas metodes
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Augu transformācijas metodes

32. Auga organisma reģenerācija
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Auga organisma reģenerācija
Diferencētas augu šūnas saglabā totipotenci – spēju de- un rediferencēties, reģenerēt veselu auga organismu

33. Auga organisma reģenerācija
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Auga organisma reģenerācija

34. Auga organisma reģenerācija
ĢM AUGA IEGŪŠANA
Auga organisma reģenerācija

35. inolil-3-etiķskābe (auksīns) citokinīni giberelīni etilēns abscisskābe
Auga organisma reģenerācija
Fitohormoni:
inolil-3-etiķskābe (auksīns)
citokinīni
giberelīni
etilēns
abscisskābe

36. (apikālās dominances likvidēšana): sānsakņu un piesakņu veidošanās;
Auga organisma reģenerācija
Auksīnu iedarbība
(apikālās dominances likvidēšana):
sānsakņu un piesakņu veidošanās;
augļu veidošanās;
fototropisms;
lapu un ziedu krišana;
DNS sintēze.

37. Auga organisma reģenerācija
Fitohormoni
Auksīni
Indoliletiķskābe, IAA; Indolilsviestskābe, IBA; Naftilēnetiķskābe, NAA; 2,4 dihlorfenoksietiķskābe, 2,4-D

38. Auga organisma reģenerācija
Citokinīnu iedarbība:
šūnu dalīšanās (citokinēze);
orgānu attīstība – asnu veidošanās;
novecošanas kavēšana, hloroplastu veidošanās;
sānu pumpuru veidošanās;
āuksīnu inducētās stiepšanās inhibīcija.

39. Auga organisma reģenerācija
Fitohormoni
Kinetīni

40. Auga organisma reģenerācija
Giberelīnu iedarbība
(līdzība ar augu patogēnās sēnes
Giberella fujikuroi = Fusarium moniliforme
iedarbību):
sēklu dīgšana;
stiepšnās garumā.

41. Auga organisma reģenerācija
Fitohormoni
Giberilīni

42. Auga organisma reģenerācija
Fitohormoni

43. ĢM AUGA IEGŪŠANA
AUGU KONSTRUĒŠANA

44. ĢM AUGA IEGŪŠANA
AUGU KONSTRUĒŠANA

45. ĢM augu šķirņu attīstība
ĢM augu paauudzes:
modeļorganismi
labākas audzēšanas tehnoloģijas, herbicīdu, kukaiņu izturība
vakcīnas un terapeitiskie proteīni
palielināta pārtikas vērtība
izturība pret sēņu un baktēriju slimībām
izturība pret sausumu un sāls stresu
1982 – pirmais ĢM augs – Km-rezistenta tabaka
1985 – pirmie lauka izmēģinājumi ar ĢM augiem
1990 – pirmā vakcīna no augiem: SpaA proteīns tabakas lapās
1992 – sēņu un baktēriju infekciju rezistence augiem
1994 – pirmais ĢM augs tirgū – FS tomāti
1996 – Bt-kokvilna, kukurūza; herbicīdu rezistenta soja, kokvilna, kukurūza un rapsis
1997 – PHB kukurūza (neizdodas attīrīt)
1999 – zelta rīss

46. ĢM augu šķirņu izveides process
Laišana tirgū
Sanie- dzamie
mērķi
Pētījumi
Tehnoloģijas izveide
Gēnu atrašana un raksturošana
Gēna funkcijas apstiprināšana
In planta
Tehnoloģijas izveide
Tehnoloģijas izveide
Tehnoloģijas izveide
Ražošanas eksperimenti
Ražošanas uzsākšana
Ražošanas izvēršana
1-? gadi
1-2 gadi
1-3 gadi
1-2 gadi
1-2 gadi
1 gads
gadi
Kritēriji darba rezultātiem katrā posmā
Bioloģiskā un biotehnoloģiskā efektivitāte
Atbilstība likumiskās regulācijas prasībām
Vides, veselības un drošības apsvērumi
Administratīvais un sociālais atbalsts
Sekmīga darbība mēroga palielināšanā (rajonēšana)
Oficiālās izplatīšanas atļaujas saņemšana
Panākumi komercializācijā

47. AUGU IZMANTOŠANA BIOTEHNOLOĢIJĀ: PRIEKŠROCĪBAS
1. Šķirņu (ģenētisku marķieru) daudzveidība
2. Liels pēcnācēju skaits
3. Reģenerācijas spējas, fitohormonu vienkāršība
4. Šūnu kultūru īpatnības
5. Ētiski motīvi

48. AUGU IZMANTOŠANA BIOTEHNOLOĢIJĀ: TRŪKUMI
1. Šķirņu un kultivāru ģenētiskais neviendabīgums, poliploīdija (kartupeļu paveidu hromosomu n 24…144)
2. Somatoklonālā variēšana
3. Sarežģījumi ar viendīgļlapjiem
4. Organellu genomu daudzveidība un izmēri
5. Ētiski motīvi

49. ĢM augu daudzveidība

50. ĢM PĀRTIKAS VEIDI
ĢM AUGI VAI TO PRODUKTUS SATUROŠA PĀRTIKA:
Nozīmīgākie procesi:
augkopība, pārtikas pārstrāde.
Izmantojamie organismi un produkti:
visbiežāk soja, kukurūza un rapsis; arī kartupeļi, rīss, saulespuķes un tomāti; iestrādes par gandrīz visām kultūraugu grupām.
Mērķi:
jaunas augu īpašības, ražošanas efektivitāte, uzlabota pārtikas kvalitāte, funkcionāla (terapeitiska) pārtika.

51. Pārtika ar uzlabotu uzturvērtību:
ĢM PĀRTIKAS VEIDI
Pārtika ar uzlabotu uzturvērtību:
tomāti ar paaugstinātu vitamīnu saturu;
zemesrieksti ar samazinātu alergēnu daudzumu;
kartupeļi ar uzlabotu cietes sastāvu;
kvieši ar palielinātu folskābes daudzumu;
rīsi ar palielinātu A vitamīna provitamīna saturu;
sojas eļļa ar augstu oleīnskābes saturu;
rapšu eļļa ar augstu laurīnskābes sāļu saturu.

52. Global Review of Commercialized Transgenic Crops. Clive James, Jan
Global Review of Commercialized Transgenic Crops. Clive James, Jan. 2013, ISAAA
2015. gadā – 180 milj. hektāru

53. ĢM augu audzētājas valstis, 2015
Salīdzinot ar gadu, audzētāju skaitam pievienojušās Kuba un Sudāna, audzēšanu pārtraukušas Vācija, Polija un Zviedrija

54. Galvenās ĢM augu grupas, 2015

55. ĢMO, kas atļauti lietošanai ES valstīs pārtikā un dzīvnieku barībā

56. Antisens – tehnoloģija gēnu apklusināšanai
g.g. ES bija atļauts izmantot un audzēt kartupeļus ar uzlabotu cietes sastāvs – apgriezts ar granulām saistītā cites sintāzes (gbss) gēns

57. HERBICĪDU TOLERANCE - IZPLATĪTĀKAIS MODIFIKĀCIJAS VEIDS

58. HERBICĪDU TOLERANCE - IZPLATĪTĀKAIS MODIFIKĀCIJAS VEIDS
REZISTENCE PRET RAUNDAPU - MODIFICĒTS EPSP SINTETĀZE

59. HERBICĪDU TOLERANCE - IZPLATĪTĀKAIS MODIFIKĀCIJAS VEIDS
Fosfinotricīns (glufosināts)
Glutamīnskābe
Fosfinotricīns ir vairāku herbicīdu sastāvā, tas kavē glutamīna sintēzi no glutamīnskābes. Fosfinotricīnu inaktivē no baktērijām iegūstams enzīms pat

60. HERBICĪDU TOLERANCE - IZPLATĪTĀKAIS MODIFIKĀCIJAS VEIDS

61. Bacillus thuringiensis
TRANSGĒNU BIOTEHNOLOĢIJA
JAUNAS, TEHNOLOĢISKI NODERĪGAS ĪPAŠĪBAS AUGIEM, PIEM., REZISTENCE PRET KUKAIŅIEM
Bacillus thuringiensis
toksīna kristāls

62. Bt toksīnu tipi

63. Bt TOKSĪNA TOKSISKUMS ŽURKĀM
ĢM AUGI LAUKSAIMNIECĪBĀ
Bt TOKSĪNA TOKSISKUMS ŽURKĀM
Agrochemical and Environmental News, April 2001, Washington State University, USA

64. Sagatavošanā Pārbaudes lauksaimniecībā
Kukurūza, kas rezistenta pret Āzijas graudu dūrēju
Rīss, kas rezistents pret baktēriju izraisītu puvi

65. Sagatavošanā Siltumnīcā Laboratorijā papaja ar aizkavētu nogatavošanos
vīrusu rezistenta papaja
Laboratorijā
mango ar aizkavētu nogatavošanos
tungro vīrusa rezistents rīss
ar vitamīnu A bagātināts rīss
pret cerošanās slimību rezistenti banāni

66. Zelta rīss
Rīsā pārnesti divi gēni no narcisēm un viens no baktērijām. Šo gēnu komplekss sintezē b-karotīnu no geranil-geranil difosfāta, savienojuma, kas rīsos parasti tālāk netiek izmantots.

67. Pret rizomānijas vīrusu rezistentas cukurbietes
Auga genomā klonēts rizomānijas vīrusa kapsīda proteīns, kura ekspresija aptur vīrusa replikāciju

68. Virus-induced gene silencing
Jaunās pieejas augu genoma modifikācijai
Virus-induced gene silencing
A. Purkayastha, I. Dasgupta / Plant Physiology and Biochemistry 47 (2009) –976

69. Virus-induced gene silencing
Jaunās pieejas augu genoma modifikācijai
Virus-induced gene silencing
A. Purkayastha, I. Dasgupta / Plant Physiology and Biochemistry 47 (2009) –976

70. Zn-pirkstu nukleāzes Genes VII, Lewin B., 2005, p. 276/382
Jaunās pieejas augu genoma modifikācijai
Zn-pirkstu nukleāzes
Genes VII, Lewin B., 2005, p. 276/382

71. Zn-pirkstu nukleāzes Jaunās pieejas augu genoma modifikācijai
Modificēta FokI endonukleāze
Zinc-finger nucleases as gene therapy agents, D Carroll, 2008

72. Jaunās pieejas augu genoma modifikācijai
TALE faktori
Transcription activator like effectors (TALEs) (Boch et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009).
TALEs are produced by plant pathogens in the genus Xanthomonas, which deliver the proteins to plant cells during infection
Proteīna-DNS mijiedarbības
specifiskums TALE efektorā
Christian M. et al., Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases, Genetics 186: 757–761 (October 2010)

73. CRISP-Cas Jaunās pieejas augu genoma modifikācijai
CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)
Cas (CRISPR-associated) genes,
CRISPR-based adaptive immune systems Terns and Terns, 2011

74. CRISP-Cas Jaunās pieejas genoma modifikācijai
Mali P. et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science, V339, p. 824, 2013