1. دستگاه وری (Instrumentation) سامانه‌های فوتولومینسانس
زهرا محمدپور، محسن سروری

2. روش های نوین شناسایی نانوساختارها
روش های طیف سنجی نوری 3

3. اجزای دستگاهی سامانه های لومینسانس
یک دستگاه لومینسانس از بخش های اصلی مختلفی تشکیل شده ‌است.
این دستگاه شامل اجزاء زیر می باشد:
منبع (Source)
تکفام‌ساز (Monochromator) یا صافی (Filter)
محفظه های نگهدارنده نمونه (Sample Holder)
آشکارسازهای بسیار حساس مثل لوله فوتوتکثیر کننده (Photomultiplier Tube)
سیستم های پردازش داده

4. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
در اغلب شرایط، سیگنال فوتولومینسانس به طور مستقیم با شدت نور تابشی به نمونه متناسب است.
بنابراین، یک منبع برانگیختگی ایده آل باید شدت نور پایدار و زیادی را در طول موج برانگیختگی مورد نظر ایجاد کند.
استفاده از لنزها و یا آینه های مناسب در منابع معمولی منجر می شود که...
بیشترین مقدار ممکن از نور منبع جمع آوری شده، تصویری از نور منبع به درون سل نمونه تابانده گردد.

5. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
انعکاس دهنده های بیضوی شکل (Elliptical Reflector) بیشترین کارایی را در جمع آوری نور منبع دارند.
انعکاس دهنده ها و منبع می توانند به صورت واحدهای مستقل از یکدیگر عمل کنند و یا در مجموع یک واحد جدایی ناپذیر را تشکیل دهند.

6. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
در فلورومترهای ساده...
از یک لامپ قوس الکتریکی جیوه ای با فشار پایین (Low Pressure Mercury Arc Lamp) استفاده می شود.
این لامپ، خطوط طیفی شدیدی در 254، 312 و 365 نانومتر ایجاد می کند که هر سه، طول موج های مناسبی برای برانگیختگی اکثر ملکول ها می باشند.

7. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
در اسپکتروفلورومترهای تجاری...
متداولترین منبع، لامپ قوس الکتریکی زنون (Xenon Arc Lamp) با فشار بالا (در محدوده 75 تا 450 وات) می باشد.
از لامپ های جیوه ای و زنون-جیوه با فشار بالا نیز استفاده می شود.
میزان درخشندگی در طول موج های نشری جیوه، بسیار بیشتر از درخشندگی لامپ زنون در همین طول موج‌هاست.

8. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
لامپ های قوس الکتریکی، به منابع تغذیه (Power Supply) بزرگی نیاز دارند که قادر باشد ولتاژ 15 تا 30 ولت و جریان های 5 تا 20 آمپر را ایجاد کند.
معمولاً منبع تغذیه طوری طراحی می شود که ولتاژ در نزدیکی قوس الکتریکی ثابت بماند، تا جریان و در نتیجه درخشندگی ثابتی ایجاد شود.
در لامپ های قوس الکتریکی در حین گرم شدن، قوس الکتریکی بین الکترودها جابجا می شود.
به این پدیده سرگردانی قوس الکتریکی (Arc Wander) گفته می شود.

9. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
سرگردانی قوس باعث تغییرات ناگهانی در سیگنال لومینسانس می شود...
به خصوص زمانی که تصویر قوس الکتریکی بر یک روزنه (Slit Aperture) کوچک منعکس شود.
در بعضی مواقع سرگردانی قوس را می توان با قرار دادن لامپ در یک میدان مغناطیسی متناوب کاهش داد.
برای جلوگیری از خطر ناشی از تولید اوزون در لامپ های با فشار بالا، محفظه نگهداری لامپ باید با دقت مهر و موم شود.

10. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
لامپ های قوس الکتریکی از جنس زنون که به صورت پالسی عمل می کنند، به عنوان منابع برانگیختگی در لومینسانس بسیار مورد توجه هستند.
این لامپ ها نسبت به لامپ های قوس الکتریکی که با جریان مستقیم کار می کنند، درخشندگی نسبی بزرگتری در طول موج های کمتر از 300 نانومتر دارند.
این لامپ ها برای اندازه گیری های فسفرسانس به شیوه Time Resolved مورد استفاده قرار می گیرند.

11. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
لامپ های دوتریوم برای برانگیختگی در طول موج های کمتر از 300 نانومتر مناسب اند.
در طول موج های کمتر از 300 نانومتر، درخشندگی لامپ های قوس الکتریکی جیوه و زنون که با جریان مستقیم کار می کنند، به شدت کاهش می یابد.
ممکن است تصور شود که نور لیزرها به دلیل درخشندگی بیشتر، گزینه های مناسبتری در مقایسه با منابع معمولی در اندازه گیری های فلورسانس باشد.
علاوه بر اینکه نیازی به استفاده از انتخابگر طول موج برانگیختگی نخواهد بود.

12. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
در حال حاضر کاربرد لیزر در سیستم های تجاری به جز در مواردی که هدف اندازه گیری طول عمر فلورسانس باشد، محدود است.

13. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
حد تشخیص برانگیختگی با لیزر معمولاً در حد سیستم هایی است که در آنها از منابع معمولی با شدت بالا استفاده می شود.
در مقایسه با منابع معمولی..
لیزرها گران تر و پیچیده ترند.
نگهداری آنها سخت تر و پایداری آنها کمتر است.
تجزیه شدن نمونه به دلیل شدت های بالای نور لیزر، یک مشکل اساسی تلقی می شود.

14. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
لیزرها و لامپ های قوس الکتریکی که به صورت پالسی عمل می کنند، به پردازنده هایی با قیمت های بالاتر و پیچیدگی بیشتر نیاز دارند.
با این وجود اسپکتروفلورومترهای مبتنی بر لیزر در برخی از آزمایشگاه های تحقیقاتی ساخته شده اند.

15. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
معروفترین لیزرها عبارتند از:
لیزر نیتروژن پالسی (337/1 نانومتر)
لیزر آرگون (488/8 و 514/6 نانومتر)
لیزرهای رنگی قابل تنظیم (Tunable Dye Lasers)
طول موج حاصل از لیزر نیتروژن برای برانگیختگی بسیاری از گونه ها مناسب است.

16. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
لیزرهای آرگون کاربردهای محدودتری دارند چون..
درصد مولکول هایی که توسط طول موج های نشر شده از این لیزرها برانگیخته می شوند، کم است.

17. منبع برانگیختگی (Excitation Source)
لیزرهای رنگی مناسب ترین هستند چون...
در این نوع از لیزرها تنظیم طول موج برای هر مولکول خاصی امکان پذیر است.
لیزرهای رنگی پالسی، با پهنای پالس کمتر از 1 نانوثانیه، برای اندازه گیری طول عمر لومینسانس بسیار مناسب هستند.

18. طول موج گزین ها (Wavelength Selection Devices)
انتخابگر طول موج در اسپکتروفلورومترها، تکفام‌ساز (Monochromator) می باشد.
انتخابگر طول موج در فلورومترها، صافی (Filter) است.

19. طول موج گزین ها (Wavelength Selection Devices)
طول موج مرکزی و پهنای باند (Band Pass) طول موج گزین های جذبی و نشری، به نحوی انتخاب می شوند که سیگنال فلورسانس را به حداکثر و سیگنال زمینه را به حداقل برسانند.
افزایش پهنای باند برانگیختگی با منابع پیوسته، موجب افزایش توان تابشی برخوردی به نمونه می شود.
به طور معمول پهنای باند برانگیختگی از 0/1 پهنای باند جذبی در نصف ارتفاع بزرگتر است.

20. طول موج گزین ها (Wavelength Selection Devices)
در ابتدای امر ممکن است به نظر برسد که این مورد می تواند منجر به غیر خطی بودن ارتباط سیگنال با غلظت آنالیت (Nonlinearity) بشود.
همچنان که در اسپکتروسکوپی جذبی به دلیل وجود نور چند رنگ (Polychromatic) با این پدیده مواجه می شویم.
این مسئله در غلظت های پایین آنالیت مشکلی ایجاد نمی کند.
در غلظت های پایین از آنالیت توان تابشی جذب شده متناسب با غلطت آنالیت است، حتی اگر ضرائب جذب مولی طول موج های پهنای باند برانگیختگی متفاوت باشد.

21. طول موج گزین ها (Wavelength Selection Devices)
هر چه پهنای باند برانگیختگی کوچکتر باشد، گزینش پذیری بیشتر است.
افزایش پهنای باند نشری با توجه به پهنتر بودن آن ( نانومتر)، منجر به افزایش سیگنال فلورسانس می شود.
تنظیم پهنای باند نشری باید به نحوی انجام شود که سیگنال آنالیت از سیگنال زمینه و پخش رامان (Raman Scattering) قابل تشخیص باشد.

22. طول موج گزین ها (Wavelength Selection Devices)
دور از انتظار نخواهد بود اگر فیلترها را طول موج گزین هایی با توانایی بالا بدانیم.
با توجه به بزرگتر بودن پهنای باند یک فیلتر در مقایسه با تکفام ساز، توانایی فیلتر 10 تا 100 برابر از تکفام ساز بیشتر است.
علاوه بر آن، سیستم های اپتیکی که برای فیلترها استفاده می شوند، عملکرد سریعتری دارند.

23. طول موج گزین ها (Wavelength Selection Devices)
فیلتر های تقاطعی (Cut off Filter) و جذبی (Absorption band Filters)، گستره پهن تری از طول موج ها را عبور داده و برای جدا کردن یک یا دو خط طیفی از منابع جیوه ای با فشار پایین کافی هستند.
این فیلترها قادرند گستره طول موجی را که در آن فلورسانس آنالیت اتفاق می افتد، عبور دهند.

24. طول موج گزین ها (Wavelength Selection Devices)
پهنای باند باریکتر فیلترهای تداخلی (Interference Filter)، گزینش پذیری بیشتری نسبت به فیلترهای جذبی ایجاد می کند.

25. طول موج گزین ها (Wavelength Selection Devices)
توانایی فیلترهای تداخلی به دلیل عبور کمتر نور، کمتر است.
نکته ای که در انتخاب فیلتر باید به آن توجه داشت این است که خود فیلترها خاصیت فلورسانی ضعیفی داشته باشند.
در صورتی که به گزینش پذیری بالاتری نیاز باشد، می توان از دو یا چند فیلتر استفاده کرد.

26. طول موج گزین ها (Wavelength Selection Devices)
به طور معمول در اسپکتروفلورومترها از تکفام سازهای با تفکیک پذیری (Resolution) متوسط استفاده می شود.
تفکیک پذیری معادل 1 نانومتر برای اکثر کاربردها مناسب است.
برای آنالیز کمی، پهنای شکاف بزرگ (0/5 تا 2 میلی متر) و پهنای طیفی 4 تا 20 نانومتر نیاز است.

27. طول موج گزین ها (Wavelength Selection Devices)
پایین بودن تابش هرز (Stray Radiation) یکی از الزامات اندازه گیری های فلورسانس است.
کسر کوچکی از نور منبع در طول موج های بلندتر می تواند به عنوان تابش هرز از تکفام ساز برانگیختگی عبور کند.
این نورتوسط نمونه پراکنده شده و با عبور از تکفام ساز نشری آشکار می شود.

28. طول موج گزین ها (Wavelength Selection Devices)
اثرات ناشی از تابش هرز با استفاده از موارد زیر به حداقل می رسد:
توری های هولوگرافیک (Holographic Grating)
تکفام ساز های دوگانه (Double Monochromator)
صافی های تقاطعی

29. طول موج گزین ها (Wavelength Selection Devices)
در برخی مواقع یک فیلتر جذبی مادون قرمز بین منبع و تکفام ساز برانگیختگی گذاشته می شود تا...
نور شدید نشر شده در ناحیه مادون قرمز را که توسط لامپ های قوسی با فشار بالا نشر می شود، مسدود کند.
این امر منجر به کاهش گرم شدن نمونه و در نتیجه کاهش تخریب گرمایی فیلترها و شکاف ها می شود.

30. محفظه های نگهداری نمونه (Sample Compartment or Sample Cells)
محفظه نگهداری نمونه شامل یک نگهدارنده سلول نمونه (Cell Holder) می باشد که باعث می شود مکان سلول نمونه به شکل تکرارپذیری ثابت باشد.
همانند دستگاه های جذب ملکولی، در فلورومترها و اسپکتروفلورومترها امکان قرار گیری چندین نگهدارنده و همچنین امکان کنترل دمای سلول و همینطور هم زدن محلول درون سلول فراهم شده است.
انواع مختلفی از سلول های نمونه در این دستگاه ها استفاده می شوند.

31. محفظه های نگهداری نمونه (Sample Compartment or Sample Cells)
در مورد فلورومترهای ساده، سلول هایی به شکل لوله آزمایش مورد استفاده قرار می گیرند.
در اغلب اوقات از سلول های مربعی شکل با ابعاد 3/4×1×1 سانتیمتر استفاده می شود.
بر خلاف سلول های جذبی که از دو سمت مخالف صیقل داده می شوند، این سلول ها از هر چهار طرف صیقلی هستنند.

32. محفظه های نگهداری نمونه (Sample Compartment or Sample Cells)
جنس سلول های لومینسانس در برخی موارد از شیشه معمولی و در اغلب موارد از سیلیکای سنتزی جوش خورده (Fused Silica) با کیفیت بالا می باشد.
سلول هایی که از جنس سیلیکای جوش خورده ساخته می شوند، قادرند درصد زیادی از طول موج های ناحیه UV را از خود عبور دهند.
این سلول ها کمترین میزان فلوسانس را از ساختار خود نشان می دهند.

33. محفظه های نگهداری نمونه (Sample Compartment or Sample Cells)
در مورد محلول های با حجم کم، سلول هایی با ابعاد میکرو طراحی شده است.
در مواردی مثل آشکارسازهای دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا، که محلول حاوی آنالیت یک جریان پیوسته دارد، از سلول های جریان پیوسته (Flow Cell) با حجم کم استفاده می شود.
تمامی انواع سلول هایی که برای فلورسانس ذکر شد، برای اندازه گیری های فسفرسانس در دمای اتاق و شیمی لومینسانس مناسب می باشند.
در صورتی که اندازه گیری در دماهای پایین انجام شود، سلول های با طراحی خاص نیاز است.

34. محفظه های نگهداری نمونه (Sample Compartment or Sample Cells)
برانگیختگی و نشر در سلولهای لومینسانس با سه شکل هندسی متفاوت انجام می شود.
حالت اول: نور نشر شده در زاویه 90 درجه نسبت به نور برانگیختگی اندازه گیری می شود.
در این حالت، سیگنال ناشی از پراکندگی کمترین شدت را داشته و به همین دلیل فرم الف بیشترین کاربرد را دارد.

35. محفظه های نگهداری نمونه (Sample Compartment or Sample Cells)
سهم فوتولومینسانس مربوط به دیواره سلول حداقل است چون..
دیواره هایی از سلول که به صورت مستقیم تحت تابش نور منبع قرار می گیرند، به طور مستقیم توسط آشکارساز دیده نمی شوند.
بلکه تنها لومینسانس مربوط به حجم کوچکی از نمونه در مرکز سلول مشاهده می شود.

36. محفظه های نگهداری نمونه (Sample Compartment or Sample Cells)
در محلول هایی که جذب زیادی دارند، قبل از رسیدن نور به مرکز سلول، مقدار زیادی از آن جذب می شود.
به این اثر، پیش فیلتر ((Prefilter Effect گفته می شود.
در صورتی که مقدار زیادی از سیگنال نشر شده قبل از خروج از سلول، توسط مولکول های آنالیت سر راه جذب شود، به این اثر ،Post filter Effect گفته می شود.

37. محفظه های نگهداری نمونه (Sample Compartment or Sample Cells)
برانگیختگی و نشر در یکی از چهار دیواره سلول نمونه انجام می شود (Frontal Geometry).
بنابراین تضعیف سیگنال لومینسانس توسط جاذب ها کاهش می یابد .
این شکل فضایی برای محلول های با جذب قوی و جامدات غیرشفاف مناسب است.

38. محفظه های نگهداری نمونه (Sample Compartment or Sample Cells)
درفرم هم راستا (In line Geometry)، نور نشر شده در زاویه 180 درجه نسبت به نور برانگیختگی اندازه گیری می شود.
این حالت کمتر مورد استفاده قرار می گیرد، چون...
طول موج گزین باید سیگنال برانگیختگی را از سیگنال ضعیف نشری تشخیص دهد.
در صورتی که طول موج برانگیختگی و نشر یکسان باشد، می توان پروفایل طیف جذبی را به دست آورد.

39. آشکارساز (Detector)
حساسیت پایین بسیاری از آشکارسازهای تجاری مانع از کاربرد آنها به عنوان آشکاساز فلورومترها و اسپکتروفلورومتر ها می باشد، چون...
توان تابشی سیگنال نشر شده بسیار کم است.
در اندازه گیری های تک طول موجی به طور معمول از فوتولوله تکثیر کننده (Photo Multiplier Tube-PMT) به عنوان آشکارساز استفاده می شود.
سطح جریان تاریکی (Dark Current) و نوفه جریان تاریکی در این آشکارسازها پایین است.

40. آشکارساز (Detector)
برای روبش کامل طیف نشری، از آشکارسازهای چند کانالی (Multichannel Detector) همانند آرایه های دیودی (Diode Array) استفاده می شود.
این امر به خصوص برای مطالعات سینتیک و شیمی لومینسانس که در آنها غلظت گونه های لومینسانس کننده با زمان تغییر می کند، مناسب می باشد.
استفاده از آرایه های دیودی در اسپکتروفوتومترها، متداول تر از اسپکتروفلورومترها می باشد.

41. پردازش داده (Signal Processing)
جریان فوتوآندی حاصل از فوتولوله تکثیر کننده، ابتدا به ولتاژ تبدیل می شود.
ولتاژ حاصل توسط تقویت کننده های عملیاتی (Operational Amplifier) تقویت شده و سیگنال خروجی توسط یک ولت متر دیجیتالی به نمایش در می آید.
به منظور کاهش سوق (Drift) و نوفه دستگاه، می بایست از قطعات الکترونیکی آنالوگ با کیفیت بالا استفاده کرد.

42. پردازش داده (Signal Processing)
برای افزایش نسبت سیگنال به نوفه، مدت زمان جمع آوری داده (Integration Time) در گستره 0/1 تا 10 ثانیه انتخاب می شود.
سرد کردن فوتولوله تکثیرکننده، منجر به کاهش جریان تاریکی و نوفه شده و در نتیجه ...
نسبت سیگنال به نوفه افزایش می یابد.
در برخی از اسپکتروفلورومترها، منبع برانگیختگی به وسیله برشگر مکانیکی (Mechanical Chopper) مدوله شده و سیگنال حاصل پردازش می شود.
به این ترتیب می توان بین سیگنال تاریکی، جریان تاریکی 1/f و نوفه تقویت کننده تمایز قایل شد.

43. پردازش داده (Signal Processing)
همانند اسپکتروفوتومترها، کاربرد میکروکامپیوترها در دستگاه های لومینسانس توانایی این دستگاه ها را به طرز چشمگیری بهبود می دهد.
کنترل پارامترهایی مثل انواع زیر، توسط صفحه کلید فراهم می شود:
سرعت اسکن طول موج
گستره اسکن طول موج
پهنای شکاف
زمان جمع آوری داده

44. پردازش داده (Signal Processing)
داده های حاصل از اندازه گیری بعد از ذخیره در کامپیوتر، توسط گزینه هایی که در نرم افزار آنالیز دستگاه وجود دارد، مورد پردازش بیشتر قرار می گیرد.
امکان انجام عملیاتی همچون موارد زیر، فراهم می شود:
فیت کردن داده های کالیبراسیون و محاسبه غلظت آنالیت
کم کردن سیگنال شاهد
محاسبه و یا نمایش طیف مشتق
محاسبه اطلاعات آماری
هموار کردن طیف ها (Smoothing)

45. پردازش داده (Signal Processing)
نرم افزارهای خاصی در دسترس اند که قابلیت کاربردهای خاصی را فراهم می کنند، مثل..
مطالعات سینتیکی
آشکارسازی در کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا
آنالیزمخلوط ها

46. بحث و نتیجه گیری
از جمله ویژگی هایی که در مورد دستگاه های کارامد برای انالیز ترکیبات فلورسانس کننده حائز اهمیت می باشد، می توان به چند مورد اشاره کرد:
حساسیت بالا به این مفهوم که دستگاه بتواند غلظت های بسیار کم را نشان دهد.
سرعت اسکن بالا از این نقطه نظر که حجم زیادی از داده های مورد نیاز را در مدت زمان بسیار کمی جمع آوری کند، این مسئله موجب آسیب کمتری به نمونه در اثر تابش نور می شود.
تطبیق پذیر باشد، به این مفهوم که بسته به نوع استفاده ای که از دستگاه می شود برای نمونه هایی با حالت های فیزیکی متفاوت بتوان از آن استفاده کرد، علاوه بر اینکه دسترسی به گستره ی وسیعی از بازه های زمانی، طول موجی و دمایی را فراهم کند.

47. بحث و نتیجه گیری
یکی از متداواترین منابع مورد استفاده در فلورومترها، لامپ های جیوه ای با فشار پایین هستند.
این منابع، بسیاری از طول موج های مورد نیاز را برای برانگیختگی ترکیبات فلورسانس کننده به صورت گسسته فراهم می کنند.
از فیلترهای جذبی به طور معمول در فلورومترها مورد استفاده قرار می گیرد.
از جمله منابع پیوسته متداول در اسپکتروفلورومترها، لامپ های قوس الکتریکی زنون با فشار بالا می باشند.
در اسپکتروفلورومترها از یک یا دو مونوکروماتورهای توری استفاده می شود.