1. Desenvolvimento e validação de métodos analíticos em CLAE/EM-EM Dra. Margareth Borges Coutinho Gallo Fortaleza, Junho de 2018

2. Tópicos  Noção de funcionamento dos componentes do sistema LC/TQ-ESI-MS  Ionização por eletrospray  Modos de varredura  Tipos de experimento (full scan, SRM)  Tipos de aquisição de dados  Fatores que influenciam a ESI  Interpretação de espectros  Mecanismos de fragmentação  Desenvolvimento e validação de método CLAE/EM-EM

3. TSQ Quantum Thermo Scientific Componentes Entrada/saída de gases (Ar e N 2 ) Fonte/Sonda Vácuo (bomba externa e turbomolecular) Ótica iônica (Sistema de lentes) Analisador: Íon de interesse pré-selecionado no 1 o quadrupolo (Q1) Ativado por colisão com o argônio (até 300 eV) no Q2 Produtos da fragmentação analisados no Q3. Detector: dinodo conversor + multiplicador de elétrons Processo: dissociação induzida por colisão em baixa energia (CID MS/MS)

4. Fonte: Ionização por Eletrospray (ESI)  Agulha/capilar com alta diferença de potencial (2,5 a 5 kV)  Campo eletrostático, íons negativos parede do capilar, neutralizados  Íons positivos para a frente do líquido: Cone de Taylor  Processo assistido pelo nitrogênio aquecido  Gotas carregadas repelidas da agulha para cone, solvente evaporando  Gotas encolhem, tensão superficial rompida (explosão Coulombica)  Processo contínuo e se repete até formar um íon na fase gasosa  A espécie iônica detectada não é o verdadeiro íon molecular mas [M+H] + ou [M-H] - http://www.bris.ac.uk/nerclsmsf/techniques/hplcms.html

5.  O cone de varredura: íons para o tubo de transferência.  Bloco de aquecimento (ESI até 270ºC): dessolvatação dos íons formados  Redução de pressão (API-vácuo) e potencial de ± 35 V empurra íons skimmer  Sistema de lentes (ótica) direciona íons p/ analisador

6. Ion Optics  A tensão de deslocamento (entre zero e ± 250 V) do tubo de lente (tube lens offset voltage), pode ser aplicada para acelerar o choque entre os íons e o N 2 da região entre o tubo de transferência e o skimmer. Esta colisão auxilia na dessolvatação dos íons, mas pode ter energia suficiente para fragmentar os íons, o que nesta etapa reduziria a sensibilidade.  Quando se sintoniza o equipamento, você ajusta esta tensão de deslocamento de modo a maximizar a sensibilidade, balanceando-se dessolvatação com fragmentação.

7. Analisador  A relação entre os potenciais rf e CC é que determina a habilidade do espectrômetro de massas de separar os íons conforme as suas m/z.  Quando ambos potenciais são aplicados, Q1 e Q3 funcionam como analisadores.  Quando somente o potencial rf é aplicado, Q1 e Q3 agem como transmissores de íons.  Os potenciais geram campo eletrostático que produz oscilações estáveis em íons com a relação m/z escolhida e instáveis para todos os outros.

8. Varredura completa entre 10 e 3000  Íons de m/z 180 são mantidos dentro das oscilações limite enquanto a velocidade deles carrega-os através do analisador de massas.  Ao mesmo tempo, todos os outros íons sofrem oscilações ilimitadas, se chocam com as superfícies do quadruoplo, se tornam neutralizados e são bombeados ou ejetados do conjunto de hastes do quadrupolo.  Posteriormente, ocorrem mudanças nos potenciais rf e CC e os íons de m/z seguinte (181) é que terão passagem permitida enquanto que todos os outros, incluindo o 180, se tornam instáveis. Este processo é contínuo, com um íon de m/z depois do outro sendo transmitido à medida que os valores de rf e CC são variados.  Ao final da varredura, os potenciais rf e CC são zerados e o processo se repete. A troca de potenciais sobre as hastes é rápida e precisa.  A varredura completa leva 0,85 segundos!!!! https://youtu.be/Jc 1uC6EbMCs

9.  Modos de varredura/experimentos Full-scan Q1 é varrido na faixa de massa desejada. Q2 e Q3 são ajustados para transmissão de íons (rf) para o detector. Varredura completa, informa as massas detectadas e condições iniciais. O espectro obtido equivalente ao de um instrumento que só contém um analisador (abundância x m/z). O pico de maior intensidade é conhecido como pico base e todos os outros têm intensidade relativa a ele.  Q1MS

10. Métodos TANDEM MS Tandem MS usa 2 estágios de análise: Full scan para selecionar o íon de interesse MS/MS para monitorar o íon Produto formado por colisão com o gás inerte ou por reações com o solvente na fase gasosa. Tandem in time Os eventos ocorrem no mesmo espaço, mas em tempos diferentes. Ex: Espectrômetros de massa Quadrupolo-Íon Trap (QIT) Tandem in space Existem dois espectrômetros de massa acoplados em série e os 2 estágios acontecem simultaneamente no tempo mas separados no espaço. Ex: Espectrômetros de massa Q-TOF

12. MS/MS  Ìon precursor: Q1 é varrido na faixa desejada, íons massa- selecionados (precursores) arrastados para Q2, colisão com argônio, fragmentação. Q3 transmite somente os íons fragmentos do analito (íons Produto). O espectro obtido mostra todos os íons precursores que fragmentam produzindo o íon produto selecionado. Detecta todos os compostos que se decompõem formando um fragmento em comum.  Ìon Produto: Q1 é ajustado para transmitir íons precursores de determinada m/z, submetidos à fragmentação no Q2 formando os íons produto. Q3 é varrido para se obter um espectro de massas que mostra os íons produto formados da fragmentação do íon precursor selecionado. Útil para identificar transições usadas em métodos quantitativos.

14.  Perda/ganho de massa neutra: Primeira fase: Q1 separa íons formados na fonte conforme relação m/z e os transmite para célula de colisão, onde são fragmentados. Segunda fase: fragmentos separados conforme relação m/z no Q3. Para um íon ser detectado, entre o tempo que o íon deixa Q1 e entra em Q3, ele deve perder uma molécula neutra cuja massa é igual à diferença dos intervalos de massas que estão sendo varridos pelos dois analisadores. O mesmo experimento pode ser idealizado para detectar um ganho/associação de molécula neutra.

15.  SRM (Single Reaction Monitoring): Adquirido no modo MS/MS “íon produto”. Íon precursor determinado anteriormente em Full Scan. Alta especificidade/seletividade, pouco provável que composto interferente tenha a mesma relação m/z para íon precursor e íon produto selecionados. Não ocorre varredura em nenhum quadrupolo, logo nenhum espectro (intensidade versus m/z) é produzido. A análise de dados obtida produz um cromatograma (intensidade de massa específica versus tempo) Transição iônica (mass-transition): par de relação m/z associado ao íon precursor e ao íon produto. Ex: ácido fosfônico (81/63)

16. No SRM, um íon precursor é selecionado no primeiro estágio da Tandem/MS (MS1) e o íon Produto, proveniente da reação de fragmentação do precursor, é selecionado no segundo estágio (MS2) para detecção.  MRM (Multiple Reaction Monitoring): ABCD + AB + CD + No MRM (aplicação do SRM) monitoramento de vários íons produtos provenientes de um ou mais íons precursores. ABCD + é selecionado no MS1 e dissocia por dois modos, formando AB + or CD +, que são selecionados no MS2 para detecção. ABCD + AB + CD + ABCD + AB + + CD Consecutive reaction monitoring (CRM) é uma aplicação em série com 3 ou + estágios de SRM. ABCD + selecionado no MS1, se dissocia em AB e CD +. O íon CD + é selecionado no MS2 e sofre outra fragmentação formando D +, que é selecionado no MS3 para detecção. ABCD + AB + CD + C + D +

17. Diazinon ESI +/TQ MS cone voltage 50-100 V  Ionização/Fragmentação Pesticidas Banoub et al., Int. J. Environ. Anal. Chem. 61: 143, 1995. 75V

18.  Rota de Fragmentação Pesticidas Banoub et al., Int. J. Environ. Anal. Chem. 61: 143, 1995. Diazinon (ESI +)/TQ SRM 1º MS/MS “ion produto” m/z 305: 169, 153, 125 Não encontrou 277 e 249 2 o MS/MS “ion produto” m/z 277: 169, 153

19.  Rota de Fragmentação Pesticidas Banoub et al., Int. J. Environ. Anal. Chem. 61: 143, 1995. Diazinon (ESI +)/TQ SRM 1º MS/MS “ion precursor” m/z 277: 305 2 o MS/MS “ion precursor” m/z 249: 277 3 o MS/MS “ion precursor” m/z 169: 305 4 o MS/MS “ion precursor” m/z 153: 305

20.  Ionização/Fragmentação Pesticidas Picó et al., Mass Spectrom. Rev,, 23: 45–85, 2004 Triazina (ESI +/Ion trap) m/z 174 – MS2 pico base. Migração H grupo metila na posição gama para o grupo amino + com perda de molécula etilenodissubstituído. m/z 146- MS3 íon precursor m/z 174; perda de etileno da cadeia lateral N-etila. m/z 104 - MS4 ion precursor m/z 132 e m/z 146 por perda de etileno do grupo N-etila e eliminação de amino nitrile, respect.

21. Fenoxi-ácidos (ESI -/Ion Trap) Picó et al., Mass Spectrom. Rev,, 23: 45–85, 2004 Em MS2, todos os compostos formam o íon Produto fenolato e eliminam uma lactona devido reação interna de cascata de elétrons desencadeada pela quebra do grupo carboxila. MS3 do íon fenolato origina fragmentos com 2 cloros para o 2,4-D e diclorprop. Carbânions são produzidos pela eliminação de HCl, seguido de abertura do anel, rearranjo de ligação e estabilização por ressonância.

22.  Centroide  O sistema detecta os picos, calcula seu centroide considerando o valor médio de m/z ponderado pela intensidade de cada pico, e atribui valores de m/z com base em um arquivo de calibração.  O espectro de massas aparece como um gráfico de barras. Este tipo de aquisição torna tanto a varredura quanto o processamento dos dados mais rápidos.  Tipos de aquisição

23. Perfil  Cada massa atômica é dividida em vários intervalos amostrais. A intensidade da corrente iônica é determinada em cada intervalo amostral e mostrada como uma linha contínua, formando uma curva gaussiana, onde cada ponto na curva corresponde à intensidade de sinal naquele valor específico de m/z.  Este tipo é usado quando se sintoniza/calibra o equipamento, pois é mais fácil de medir a resolução.  Tipos de aquisição

24.  Influência na eficiência da ionização Parâmetros instrumentais  Tensão de ionização na sonda  Pressão do spray/do gás nebulizador (N 2 )/do gás de colisão (Ar)  Temperatura da sonda  Potencial  Energia de colisão  Fluxo

25. Fluxos menores aumentam a sensibilidade do método e demandam menor manutenção do equipamento. Ìons de massa pequena demandam alta amplitude da tensão do quadrupolo para que ocorra a fragmentação. Os parâmetros instrumentais devem ser determinados experimentalmente por meio da injeção da solução padrão do analito e avaliação visual da sensibilidade (signal-to- noise ratio).

26. Clorpirifós-metil-2 –TQ MS cone voltage 50, 60, 75, 100 V Abundância isotópica 35 Cl e 37 Cl Adutos de sódio Banoub et al., Int. J. Environ. Anal. Chem. 61: 143, 1995.

27. Características do solvente Água sozinha não é bom solvente: Alta viscosidade que acarreta baixa mobilidade dos íons e dificuldade em se obter um spray estável. Alta tensão superficial, que acarreta formação de gotas grandes e desintegração mais difícil. Baixa volatilidade e solvatação eficiente dos íons, que dificulta a vaporização e se traduz numa baixa resposta na análise  Volatilidade  Tensão superficial  Condutividade  Concentração eletrolítica  Constante dielétrica  Força iônica  pH  Reações íon-molécula na fase gasosa

28. Aplicação de campo elétrico forte na ponta da agulha Migração eletroforética das espécies iônicas no solvente, diretamente correlacionada com baixa concentração do analito e boa condutividade do solvente Produz íons dos analitos na fase gasosa e grandes quantidades de íons dos solventes que agem como íons reagentes nas reações íon-molécula na fase gasosa A determinação da fase móvel ótima e do desenvolvimento do método LC/ESI-MS demanda uma compreensão dos efeitos do solvente na eficiência da ionização e no comportamento cromatográfico.

29.  Hidrofobicidade Quanto menor, maior a capacidade de formar ligações hidrogênio, maior a solubilidade na água, menor sua afinidade pela superfície o que acarreta supressão do sinal. Características do analito Picó et al., Mass Spectrom. Rev, 23: 45–85, 2004  Atividade superficial  Energia de solvatação  Afinidade protônica

30.  Na ESI modo positivo, prótons originados do solvente se chocam com moléculas neutras do analito na fase gasosa protonando-as, se a afinidade por prótons (AP) do analito na fase gasosa for maior do que a do solvente. Solvente com alta AP pode suprimir a ionização de analitos com baixa AP.  Na ESI modo negativo, a transferência de prótons ocorre do analito para as espécies negativas formadas do solvente se a AP destes for maior que do analito

31.  Desenvolvimento do Método Fase Estacionária Reversa C18 e C8 (RPLC) Ion-pair reversed-phase (IPRPLC) ion exchange (IELC) Fase móvel MeOH, MeCN Ácido acético, ácido fórmico, hidróxido de amônio Acetato e formato de amônio Tampão ≤ 10 mM “Wright way ionization” ESI melhor resposta analitos ionizados Analitos básicos, fase móvel ácida (pH 2x < pKa do analito) Analitos ácidos (pH 2x > pKa do analito) LC em fase reversa Melhor TR e resolução em pH onde analitos básicos ou ácidos se encontrem não ionizados

32. Kostiainen & Kauppila, J. Chromatogr. A 1216: 685–699, 2009 “Wrong-way-round ionization” Moléculas neutras ou fracamente básicas fortemente protonadas em fase móvel básica Moléculas fracamente ácidas abundantemente desprotonadas em fase móvel ácida Análise de resíduos medicamentos em água de reuso Sulfonamida e tetraciclina (base; ESI +) Estrogênios (ácido; ESI -) Otimização: ESI + e -, pH 2,6 e 10 pH FM 10 ajustado com NH 4 OH Menor LD, maior sensibilidade

33. Kostiainen & Kauppila, J. Chromatogr. A 1216: 685–699, 2009 Em desacordo com o mecanismo de evaporação iônica, onde um aumento na concentração do aditivo suprimiria a ionização. Observado: na ESI + ionização ocorre na fase gasosa via reação de transferência de prótons ou em reações na interface líquido gasosa da gota.

34. Wu et al., Anal Chem. 76(3): 839–847. 2004 Os prótons provenientes do solvente e analito são reduzidos, formam H 2. Os prótons do aditivo ácido também são reduzidos, acúmulo de cargas negativas na superfície das gotas devido à repulsão elétrica. Aumento pH na superfície da gota e favorecimento desprotonação dos analitos. ESI negativo

35.  Desenvolvimento do Método Picó et al., Mass Spectrom. Rev,, 23: 45–85, 2004 Clormequat Sílica BDS

36.  Validação do Método TR analito 2x > Tempo morto e cerca de ±0,1min do TR padrão. Soluções padrão contendo múltiplos pesticidas em solvente devem ser comparadas com soluções padrão individuais de cada pesticida para confirmar similaridade na resposta do detector. Quando a amostra tiver níveis de resíduos acima da faixa de calibração, deverá ser diluída e reinjetada. Se a curva contemplar efeito matriz, a concentração da matriz também deverá ser diluída proporcionalmente. SANTE/11813/2017. Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed. Exigências para a cromatografia Se o método cobrir 40 analitos, deverá ser calibrado com pelo menos 25 analitos representativos. Se cobrir 20, deverá ser calibrado com todos. O modo mais efetivo de compensar efeito matriz é por adição de padrão ou o uso de padrão interno isótopo marcado.

37.  Validação do Método SANTE/11813/2017. Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed. Exigências para a espectrometria O laboratório deverá criar seus próprios critérios para identificação do TR analito e demonstrar que são apropriados. O espectro de referência deve ser obtido nas mesmas condições e equipamento da análise, e na mesma bateria de análise. Para evitar distorções de m/z, a concentração do analito não deve sobrecarregar o detector. Na medidas obtidas em Full scan, o processamento deve ser aplicado uniforme e igualmente para toda a bateria e ser gravado. Seleção do pico para identificação: íon molecular, molécula (des)protonada, adutos. Outras evidências: abundância isotópica, íons produto adicionais, massas de alta resolução. TR, forma do pico e taxa de resposta similar ao do padrão obtido na mesma bateria.

38. Não levar ao pé da letra! O critério dado é só um guia, mas a interpretação complementar é o que conta!!!! SANTE/11813/2017. Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed.

39.  Validação do Método SANTE/11813/2017. Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed. Exigências para a espectrometria A relação m/z obtida nos espectros das amostras não deve variar mais que 30% em relação as obtidas na solução padrão na mesma bateria de análise. A variabilidade existente na relação m/z deve ser determinada primeiramente na solução padrão durante a validação do método e depois no procedimento de rotina como parte do controle de qualidade. Tolerâncias muito grandes podem levar a grande número de falsos positivos assim como tolerâncias pequenas podem elevar o número de falsos negativos. Quando o LSE é ultrapassado, recomenda-se uma reanálise de outra porção da amostra ou até mesmo uma análise por outra técnica complementar.

40. Efeito matriz Picó et al., Mass Spectrom. Rev,, 23: 45–85, 2004 A ESI é altamente susceptível a efeitos de supressão de sinal quando algum componente de amostras de alimento ou ambientais são ionizados junto com o analito de interesse. Preparo/limpeza da amostra para extração/redução dos interferentes com poucos passos para evitar perda do analito interesse. Se necessário, escolher uma calibração com adição de padrão ou superposição de matriz.

41. margareth.gallo@gmail.com