1. Ērlihiozes un ērču encefalīta izsaucēju
molekulārā bioloģija
(Projekts LU13 , 2003.g.)
Projekta vadītāji: Prof. V.Baumanis - LU Bioloģijas fakultāte
Prof. A.Žilevica LU Medicīnas fakultāte
Izpildītāji: R.Ranka PhD stud.biol.
A.Bormane - PhD stud.biol.
A.Zeltiņa stud. pharm.
L.Timša stud. biol.bac.
V.Šķipars stud. biol.bac.
K.Salmiņa mag.biol.
I. Zeltiņa PhD stud.med. RSU
Konsultanti: V.Sondore - Dr.med., Valsts Infektoloģijas centrs
B. Rozentāle - Dr.med., Valsts Infektoloģijas centrs,RSU
A.Dūks Dr.med., Sabiedrības Veselības aģentūra

2. Saslimšanas gadījumu skaits ar ērču encefalītu Z-Eiropā un Krievijas ZR daļā
Latvijā 2003.g saslimšanas gadījumi, t.i., 15,66 gadījumi uz iedzīvotāju

3. Pētījumu aktualitāte Saslimstība Latvijā Kur ir labāk Kur ir sliktāk
(uz
iedzīvotājiem)
Ērču encefalīts , ,01(Norv) ,8 (Est)
Erlichioze ? ? Zināms vienīgi,ka
Zviedrijā ap 5%
ērču inficētas
Laima borelioze , ,1(Norv) ,3 (Lt)
Babezioze ? ? Vācijā 1,9% ērču
inficēts
Riketsiozes ? ? Vācijā ~ 9% ērču
Wollbachias ? ? Vācijā ~ 1% ērču
Koksiellozes ? ? ?
(Q drudzis)

4. 1. Izstrādāt minēto infekciju molekulārās detektēšanas
Pētījumu mērķi
1. Izstrādāt minēto infekciju molekulārās detektēšanas
metodes uz polimerāzes ķēdes reakcijas pamata,jo:
a) ērču encefalīta vīrusu (TBEV), kā arī ērlihijas ir grūti kultivēt
b) lai noteiktu ērču inficētības pakāpi , nepieciešmi salīdzinoši
dati, kas iegūti ar dažādām metodēm
2. Veikt minēto infekciju molekulāro tipēšanu:
a) epidemioloģiskiem pētījumiem
b) mikroorganismu celmu dažādās patogenitātes analīzei, jo piemēram,
ērču encefalīts (TBE) raksturojas ar ļoti dažādu klīnisko formu
smagumu, kuru cēlons nav zināms
c) mikroorganismu evolūcijas prognozēšanai
d) terapijas un profilakses pasākumu izstrādāšanai - vai ir atbilstība
starp Latvijā lietoto vakcīnu vīrusu genotipiem un ērču vīrusiem
3. Mēģināt raksturot virēmijas intensitāti un ilgumu ,
salīdzinot to ar TBE klīniskās formas smagumu

5. TBEV subtipu izplatība Eirāzijā
Rietumu subtips- pārnēsā I.ricinus (dzeltens) letalitāte 0,5 - 2 %
Tālo Austrumu subtips- pārnēsā I.persulcatus (sarkans) - letalitāte %
sastopami abi subtipi (oranžs)

6. TBE diagnosticēšanas metodes
Tiešās
(vīrusa noteikšana)
RT- PCR
Elektronmikroskopija
Vīrusu kultivēšana
Netiešās
(antivielu noteikšana)
ELISA
Immunoblotēšana
Hemaglutinācijas inhibīcijas tests (HIT)
Vīrusu neitralizācijas tests (NT)
Komplementa fiksācijas reakcija (CFR)

7. TBEV struktūra Sastāv no trīs strukturālajiem proteīniem:
E- apvalka glikoproteīns
(imunogēnais)
M- membrānas glikoproteīns
C- kapsīdas proteīns

8. Ērču encefalīta vīrusa genoms un tā tipēšana
Vienpavediena RNS , dažādiem celmiem nukleotīdu gara,
kodē 3 struktūras proteīnus:
V1(M) - kopā ar E proteīnu piedalās apvalka veidošanā
V2(C) - core proteīns
V3(E) - apvalka proteīns, glikoproteīns, ar hemaglutinīna īpašībām,
šis antigēns inducē neitralizējošo antivielu biosintēzi
7 nestrukturālie proteīni NS1, NS2A, NS3, NS4A, NS4B, NS5, tie
sintezējas kā poliproteīns, kurš vēlāk sašķeļas, funkcijas nezināmas
Detektēšanai izmanto:
5’- terminālā gala nekodējošā rajona 128 nukleotīdu garu fragmentu
Detektēšanai un tipēšanai izmanto:
NS5 proteīna kodējošā rajona 252 nukleotīdu garu fragmentu

9. Darba shēma Ērču materiāla savākšana Klīniskā materiāla izvēle
TBE vīrusa RNS izolēšana (fenola - hloroforma metode vai QIAamp® Viral Mini Kit)
Ērlihiju nukleīnskābes izolēšana - fenola - hloroforma metode
Ērlihiju DNS fragmentu PCR amplifikācija
TBEV cDNS sintēze (reversā transkripcija)
Rezultātu analīze 2,5% agarozes gēlā vai 8% PAAG
Atsevišķu amplikonu skvenēšana

10. Metodes jūtības noteikšana
TBEV 5'NCR rajona RT-PCR amplifikācijas produktu elektroforētiska analīze 8% PAAG gēlā
1. celiņš - DNS garuma marķieris
2., 3., 4., 5., 6., 7., 8., 9. celiņi - ērču encefalīta K23 celma antigēna (Encepur vakcīna) atšķaidījumi, solis - 10x
6. celiņš - robežatšķaidījums, 9,8 fg TBE vīrusa RNS
10. celiņš - negatīvā kontrole
184bp
124bp
Sekvenēšanas rezultāti pierādīja amplikonu specifiskumu

11. TBE vīrusa nekodējošā rajona (5’NCR) fragmenta RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction) metodes jūtība tika noteikta 9,8 fg TBE vīrusa RNS • TBE vīrusa NS5 gēna fragmenta RT-PCR metode uzrādīja zemāku jūtību - apmēram 900 fg TBE vīrusa RNS

12. TBE vīrusa detektēšana ērcēs I
TBEV 5'NCR rajona RT-PCR amplifikācijas produktu elektroforētiska analīze 2,5% agarozes gēlā.
3., 4. celiņš- Encepur vakcīna (172 bp)
5.celiņš- Krievijā ražota TBE vakcīna
2.celiņš- negatīvā kontrole
1.celiņš- DNS garuma marķieris
267bp
184bp
1., 5., 7., 8.celiņš- PCR produkti no neinficētām ērcēm
2., 3., 4., 6.celiņš- PCR produkti no inficētām ērcēm
11.celiņš - DNS garuma marķieris,
10.celiņš- pozitīvā kontrole
9.celiņš- negatīvā kontrole
267bp
234bp
213
192
184

13. TBE vīrusa detektēšana ērcēs II
TBEV NS5 gēna fragmentu RT-PCR amplifikācijas produktu elektroforētiska analīze 8% PAAG gēlā.
1.celiņš- pozitīvā kontrole (252 bp)
2.celiņš- DNS garuma marķieris
3.celiņš- negatīvā kontrole
5.celiņš- PCR produkts no inficētām ērcēm
6., 7.celiņš- PCR produkti no neinficētām ērcēm.
267bp
234bp

14. TBEV detektēšana ērcēs III
Tika analizēti 12 ērču grupu (60 ērces, pa 5 vienā grupā) un 22 individuālu ērču paraugi, RNS izolēšanai izmantoja fenola-hloroforma metodi
no 22 individuālajām ērcēm, kas bija piesūkušās cilvēkiem, 17 iepriekš bija noteiktas TBEV pozitīvas ar ELISA metodi, ar 5’NCR fragmenta RT-PCR metodi pozitīvu rezultātu deva 1 paraugs (glabāti paraugu lizāti)
ar 5’NCR fragmenta RT-PCR metodi TBEV pozitīvas bija 7 no 12 dabā savākto ērču grupām (11%)
ar NS5 gēna fragmenta RT-PCR metodi TBEV pozitīvas bija 3 no 12 dabā savākto ērču grupām (5%)

15. Sabiedrības veselības aģentūras dati
(2003.g. - 6,7%)
(2003.g. ~ 18%)

16. TBEV detektēšana asins plazmas paraugos
• Ar TBEV 5’NCR fragmenta RT-PCR metodi tika analizēti 13 TBE slimnieku asins plazmas paraugi, vīrusa RNS izolēšanai tika izmantots QiAamp Viral Mini-kits • Paraugi bija ņemti no dažādiem slimniekiem, un visos paraugos iepriekš ar ELISA metodi bija apstiprināta specifisko antivielu pret TBEV klātbūtne, antivielu titrs paraugiem bija dažāds • Ar TBEV 5’NCR fragmenta RT-PCR metodi visi 13 asins plazmas paraugi uzrādīja negatīvu rezultātu

17. Erlihiju taksonomisko raksturojumu
mēģina precizēt pēc 16S rRNS secības

18. Ērlihiju detektēšanai izmantotais 16S rRNS gēna fragments

19. Polimerāzes
ķēdes
reakcijas
dati rāda,
ka ērlihijas
Latvijas
ērcēs ir

20. Secinājumi
RT-PCR metode ir perspektīva TBE vīrusa detektēšanai ērču materiālā, nākotnē šī metode varētu sniegt iespēju diferencēt dažādos TBE vīrusa subtipus
Izvēlētās RT-PCR metodes jūtība ir pietiekoši liela, taču tās pielietošanu ierobežo neskaidrā virēmijas aina TBE slimniekiem un RNS nestabilitāte
Pirmoreiz Latvijā ar molekulāram metodēm pierādīta ērču inficētība ar ērlihijām

21. Neatrisinātie jautājumi
Vai virēmija TBE gadījumos ir vai nav novērojama un ja ir, tad:
a) kurā slimības stadijā to novēro
b) vai virēmijai ir kāda saistība ar antivielu titru
c) vai vīruss nesorbējas uz eritrocītiem
Kādu sugu ērcēs , to attīstības stadijās biežāk novērojama to inficētība ar TBEV un ērliijām
Kāda genotipu TBEV un ērlihiju variabilitāte sastopama Latvijā
Vai ir kāda sakarība starp TBEV genotipu un TBE klīniskās formas smagumu
Vai cilvēki Latvijā ar ērlihiozēm neslimo, vai tās vienkārši netiek atklātas
Kuri gēnu produkti ir mikroorganismu patogenitātes faktori un kuri gēnu produkti izraisa neitralizējošo antivielu vai šūnu imunitātes atbildi
Makroorganisma nozīme minēto infekciju gaitā
Kā evolucionē mikroorganismu ģenētiskie tipi

22. Publikācijas, disertāciju darbi un uzstāšanās par projekta rezultātiem
1. R.Ranka, A.Zeltiņa , A.Bormane, I.Zeltiņa.Ērču encefalīta vīrusa detektēšana ar molekulārās bioloģijas metodēm - Latvijas Universitātes 62. Zinātniskā konference , 2004.g.
2. Bormane A., Lucenko I., Duks A., Mavchoutko V., Ranka R., Salmina K., Baumanis V. Vectors of tick-borne diseases and epidemiological situation in Latvia in International Journal of Medical Microbiology. 2003, v.293,
3. R.Ranka. Ērču izraisīto infekciju - laima slimības un encefalīta molekulārā diagnostika. Disertācija aizstāvēta 2004.g.2.jūnijā
4. A.Bormane. Ixodes ērču un to pārnēsāto patogēnu pētījumi.
Pašreiz norit eksperimentālā materiāla vākšana disertācijai (aizstāvēšana tiek plānota uz g.)
5. Bormane A., Ranka R., Salmina K., Lucenko I . Natural foci of tick-borne diseases and epidemiological situation in Latvia during the last decade. VII International Simposium on Tick-borne diseases, Berlin, 2003
6. R.Ranka, A.Bormane, V.Baumanis. Molecular studies on tick-born disease causing agents in Latvia. Abstracts of 29th FEBS Congress. Warsaw, Poland, June 26-30,2004 (accepted).

23. Saskarsme ar citiem pētniecības projektiem
LZP projekts Latvijā sastopamo Borrellia sugu un Borrelia burgdorferi tipu molekulāri ģenētiska izpēte
Iesniegts projekts EC 6. Satvaram : EDEN - Tick-born diseases.
Koordinators S.E.Randolf , Oxford University, UK.
Kā līdzdalībnieki ir 13 valstis
Iesniegts projekts EC 6. Satvaram: PatoGenoMics.
Koordinators W.Diekmann (Vācija)
Kā līdzdalībnieki 8 valstis